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　　做過分子實驗的人都知道，要想做的有效率有質(zhì)量是很苦逼的，1 個月做 100 個克隆那都是 小 case，沒點看家的本事怎么行。如果再遇到比較稀有的基因，周旋個把月，那也是家常便飯。下面遠(yuǎn)慕生物和大家分享一些載體構(gòu)建的經(jīng)驗，從此邁向科研達(dá)人！

　　1. 準(zhǔn)備工作

　　俗話說：用欲善其事，必先利其器。建議大家在做構(gòu)建之先找好工具，效果事半功倍哦。 推薦兩個工具，一個是 oligo 軟件，常用于引物設(shè)計和酶切位點分析；另一個是 DNAstar 軟件，工具強大，一款全面的生物醫(yī)學(xué)軟件，用作 DNA 和蛋白質(zhì)序列分析、重疊群拼接和基因工程管理。

　　2. 設(shè)計引物

　　1) 注重要：看懂質(zhì)粒圖譜！拿大家比較熟悉的 PEGFP-C1 和 PEGFP-N1 做例子。 想用 N1 質(zhì)粒，設(shè)計引物就得把下游引物上的中止密碼子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下來 結(jié)果根本不表達(dá)融合蛋白，你就死了；C1 質(zhì)粒，注意閱讀框，要是移碼了，你也死了。而且 139PEGFP 系列有 1.2.3，要弄清楚別弄竄了。一句話，要看懂你的圖譜！

　　其他需要注意：

　　*設(shè)計酶切位點時要加保護堿基（大家要用 T 載體就當(dāng)我沒說）;

　　*酶切位點設(shè)計原則：盡量用粘性末端，實在不行就用一些常用平端酶，如 EcoRV 和 SnaB1 等，要是以后還有別的用處就多加點酶切位點，曾一口氣在引物上加了五個酶切位點以防以后要用到，注意計算 TM 值的時候要減去這些不匹配的序列；

　　*注意 KOZAK 序列的問題，很多質(zhì)粒沒有提供 KOZAK 序列，這要在設(shè)計的時候直接在引物上加好。

　　*擅用 Gene Overlap，比方說加個 flag 標(biāo)簽，his 標(biāo)簽，my 標(biāo)簽之類的，直接設(shè)計三引物 overlap 一下就可以，省得還要再多構(gòu)建一步，這些都是設(shè)計引物時候就要考慮好的。引物長一點不要緊（兩步法），尤其是對 GC 比高的序列，有時候引物不長 PCR 根本不出結(jié)果，注意如果 GC 比較高，這個時候 Gene Overlap 就不要做了，很麻煩，克隆很難挑。

　　*沒有合適的酶切位點？很簡單，用同尾酶策略，比方說 Bgl2 和 BamH1，Nhe1 和 spe1，Xho1 和 Sal1（注意連上了切不下來），實在不行就平端吧。

　　3. PCR 擴增

　　如果沒有現(xiàn)成的質(zhì)粒可供酶切，PCR 是很理想也是很方便的策略。目市面上可選擇的 PCR 酶實在太多，每隔一段時間還會升，正常情況下，高保真的 taq 酶都能滿足需求。但如果遇到難 PCR 的高 GC 基因，可以換不同 PCR 酶，添加一些 DMSO，甘油等，實在不行可以考慮 Clontech 的 2 GC rich kit，價格和實力都大牛。另外，建議電泳切膠回收純化 PCR 產(chǎn)物， 去除一些非特異性條帶。

　　4. 酶切

　　強烈推薦 NEB 的內(nèi)切酶，記得有一次用別家的酶切過夜，結(jié)果質(zhì)粒都被切碎了（當(dāng)然當(dāng)時質(zhì)粒濃度也不高），而用 NEB 的酶，切個七十二小時仍舊一切 OK，尤其現(xiàn)在 NEB 還推出了 HF 的內(nèi)切酶，沒有星活性而且統(tǒng)一都用 Buffer4。另外 TAKARA 的酶也還可以。

　　5. 連接

　　常用的是 NEB 的 T4 連接酶，很好用，但是注意 Buffer 里有 ATP，反復(fù)凍融 ATP 失活很快， 拿到 buffer 后就分裝，10uL/管，一次性使用。

　　載體總量：一般來說，載體濃度在 20-100ng/uL 較好，太低的話碰撞幾率低，太高的話又會產(chǎn)生很多非目的克隆，總量從 50-100ng 就可以，太低失敗幾率很高，太高克隆太多，挑克隆會很麻煩，反應(yīng)總體積也有講究，體積太大載體和目的片段碰撞幾率太低，而且對感受態(tài)細(xì)胞也是個挑戰(zhàn)，通用 10-15uL。

　　載體和插入片段比例：載體和插入片段比例一般是 1:7，如果很難連接，比如說平端連接，要適當(dāng)提高片段濃度，同時加大比例 1:10。

　　6. 轉(zhuǎn)化

　　按照 SOP 做就行，話說實驗室原來從 takara 買感受態(tài)（competent cell），后來發(fā)現(xiàn)還是自己做的效率高（protocol 免費索�。�。要注意的是 LB 必須無菌而且沒有抗生素。

　　7. 鑒定

　　想要快速鑒定，建議用菌液 PCR，菌液 PCR 是有一定講究的，很多人做菌液 PCR 鑒定假陽性特多，為什么？因為你 PCR 引物選的都在載體上，注意引物必須分別在載體和插入片段上才準(zhǔn)，PCR 方法鑒定是其準(zhǔn)確的，數(shù)百次菌液 PCR 經(jīng)驗。PCR 鑒定做起來也很簡單， 拿個 2mL tube，裝 0.5mL 加入相應(yīng)抗生素的 LB，搖個三小時左后取 1uL 做模板就行了。如果想更快，直接菌落 PCR 也不錯，效果一樣。

　　8. 測序

　　拿到測序結(jié)果時，不僅要核對序列，還要看測序峰圖，這很重要。因為有時候光看序列對，實際上圖顯示的不對，或者雖然序列結(jié)果不對，但是圖上出現(xiàn)的峰值本身就很怪異不可信，出現(xiàn)突變也不怕，有很大可能性是簡并密碼子；還要重點檢查的地方就是“接頭”的地方，因為偶爾引物會出錯，比方說少個堿基什么的，還有時候酶切之后連接也會丟一兩個堿基什么的，如果不仔細(xì)檢查到了后期悔之無及。