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RNAi：制備siRNAs的方法
閱讀次數(shù)：434 發(fā)布時(shí)間：2022/4/25 11:31:51

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　　越來越多的研究人員開始采用小分子干擾RNA（small interfering RNAs，siRNAs)來抑制特定的哺乳動(dòng)物基因表達(dá)。siRNA是一種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA，這個(gè)過程就是RNA干擾途徑（RNA interference pathway）。RNAi的應(yīng)用包括功能基因組學(xué)，藥物靶篩選，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路分析等等。

　　目為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括

　　· 化學(xué)合成

　　· 體外轉(zhuǎn)錄

　　· 長(zhǎng)片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)

　　· siRNA表達(dá)載體或者病毒載體在細(xì)胞中表達(dá)siRNAs

　　· PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)

　　面3種方法包括體外制備siRNAs然后經(jīng)過轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后面兩種方法則依賴能夠表達(dá)siRNAs的DNA載體或者表達(dá)框轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。每種方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。哪種是好的方法，其實(shí)取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹＿@里簡(jiǎn)單介紹這5種方法，優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，以及它們適合的應(yīng)用。

　　siRNA的設(shè)計(jì)

　　除了方法3以外，其他的方法都在制備siRNA 都需要單獨(dú)設(shè)計(jì)siRNA序列。關(guān)于怎樣設(shè)計(jì)siRNA以及siRNA設(shè)計(jì)對(duì)siRNA功能的影響，盡管我們不斷掌握越來越多有關(guān)設(shè)計(jì)原則的信息。但這仍然不是精確的。通常來說，每個(gè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)3—4對(duì)siRNAs，在后面的實(shí)驗(yàn)中選擇有效的那個(gè)。網(wǎng)上有提供免費(fèi)的siRNA設(shè)計(jì)工具。

　　體外制備

　　1.化學(xué)合成

　　盡管化學(xué)合成是貴的方法，但是卻是方便的——研究人員幾乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長(zhǎng)，特別是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成3—4對(duì)siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。

　　適用于：已經(jīng)找到有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究

　　不適用于：篩選siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素

　　2.體外轉(zhuǎn)錄

　　通過體外轉(zhuǎn)錄的方法可以合成siRNAs，這樣的成本相對(duì)化學(xué)合成法而言比較低，是一種性價(jià)比高的篩選siRNAs的好方法。更重要的是采用這種方法能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。以Silencer siRNA Construction Kit為例，一旦得到DNA Oligo模版（這個(gè)還是需要DNA合成的，不過DNA合成的成本就比較低了），只要24小時(shí)就可以，不需要等很久。這個(gè)方法的不足之處是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研究人員相當(dāng)?shù)臅r(shí)間——畢竟，化學(xué)合成只需要定購就可以了。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs只要較低的濃度就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNAs較高濃度得到的效果（0.5-20 nM vs. 50-100 nM per transfection ，圖2）

　　適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。

　　不適用于：實(shí)驗(yàn)需要大量的，一個(gè)特定的siRNA。長(zhǎng)期研究。