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　　為啥你的細(xì)胞不愿貼壁呢？如何促進(jìn)細(xì)胞貼壁？

　　根據(jù)細(xì)胞特性分類

　　1、 懸浮細(xì)胞（Suspension Cell）

　　細(xì)胞生長(zhǎng)不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，如淋巴細(xì)胞。

　　2、 貼壁細(xì)胞（Adherent Cell）

　　在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，必須有可以貼附的支持物表面，依靠自身分泌或培養(yǎng)基中的粘附因子才能在該表面生長(zhǎng)增殖的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞在該表面生長(zhǎng)后，一般形成兩種形態(tài)，即成纖維樣細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞。

　　3、 兼性貼壁細(xì)胞

　　有些細(xì)胞并不嚴(yán)格地依賴支持物，它們既可以貼附于支持物表面生長(zhǎng)，但在一定條件下，也可在培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。

　　貼壁細(xì)胞分為：上皮細(xì)胞型，成纖維細(xì)胞型，游走細(xì)胞型和多型細(xì)胞型，在顯微鏡下觀察時(shí)，貼壁細(xì)胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不規(guī)則的三角形或扇形或其他形態(tài)，而且晃動(dòng)培養(yǎng)液時(shí)，細(xì)胞不動(dòng)。常見的貼壁細(xì)胞有成纖維細(xì)胞、骨骼組織（骨及軟骨）、心肌與平滑肌、肝、肺、腎、乳腺皮膚、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、黑色素細(xì)胞以及各種腫瘤細(xì)胞等。
 

　　體外培養(yǎng)貼壁細(xì)胞特點(diǎn)

　　貼附并伸展，是多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本生長(zhǎng)特點(diǎn)。細(xì)胞貼壁的過程使形態(tài)發(fā)生很大變化，細(xì)胞形態(tài)改變是細(xì)胞內(nèi)骨架（真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系，由微管、微絲及中間纖維組成的體系）本身和細(xì)胞外基質(zhì)共同作用的結(jié)果。培養(yǎng)細(xì)胞在未貼附于底物般均似球體樣，當(dāng)與底物貼附后，細(xì)胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)，呈成纖維細(xì)胞樣或上皮細(xì)胞樣等。細(xì)胞附著于底物時(shí)并非一種需要能量的過程，一般認(rèn)為與電荷有關(guān)。據(jù)資料記載，37℃時(shí)在2min內(nèi)細(xì)胞之間即可形成鍵，該鍵可對(duì)0.01%胰蛋白酶起作用且僅發(fā)生于細(xì)胞間，細(xì)胞與底物之間則無；8min后才有穩(wěn)定的鍵形成。

　　貼壁細(xì)胞（除腫瘤細(xì)胞外）在體外培養(yǎng)條件下，完成貼壁后均為單層生長(zhǎng)，原因是貼壁細(xì)胞有接觸性抑制的特點(diǎn)。一般認(rèn)為接觸抑制是細(xì)胞間的一種識(shí)別作用，對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)形成與穩(wěn)定具有重要性的作用。由于貼壁細(xì)胞的一面是緊貼在培養(yǎng)瓶上的，如果其上方存在細(xì)胞與其相粘附，那么下方的細(xì)胞很快就會(huì)缺乏營(yíng)養(yǎng)－－-餓死。

　　接觸抑制：

　　1954年，由艾伯克龍比發(fā)現(xiàn)，一些細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中達(dá)到相互接觸時(shí)停止分裂現(xiàn)象，將其命名為接觸性抑制（Contact Inhibition），后來證實(shí)接觸性抑制普遍存在于貼壁細(xì)胞之間。

　　接觸抑制的原理：細(xì)胞膜上有糖類和蛋白質(zhì)共同構(gòu)成的糖蛋白，也叫做糖被，它在細(xì)胞上起識(shí)別作用，當(dāng)細(xì)胞增殖到一定程度，挨在一起時(shí)，糖蛋白就會(huì)識(shí)別這種信號(hào)，并且使細(xì)胞停止繁殖。

　　細(xì)胞為什么要貼壁

　　先并不是所有的細(xì)胞在體外培養(yǎng)的情況下都會(huì)貼壁，但大部分來自實(shí)體組織器官的細(xì)胞都會(huì)貼壁。

　　密度大于培養(yǎng)基的細(xì)胞（絕大部分細(xì)胞）通過重力作用會(huì)沉降在底面上，這是種自然屬性，那么細(xì)胞要生存必定得改善這個(gè)環(huán)境，也是貼壁的主要原因-分泌細(xì)胞外基質(zhì)和粘附因子（Extracellular matrix& Cell Adhesion Molecules，ECM&CAM），改善底面的結(jié)構(gòu)，然后很自然就貼附在底面上了。

　　細(xì)胞粘附分子：

　　是眾多介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱。

　　細(xì)胞外基質(zhì)：

　　是由動(dòng)物細(xì)胞合并分泌到胞外、分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子。

　　二者大多數(shù)均為糖蛋白，因此具有較強(qiáng)的親水性——因此能不能貼壁不僅僅關(guān)乎細(xì)胞是否有這種能力，也與有無合適的底物（培養(yǎng)瓶）有關(guān)。

　　密度小于水的細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞，漂浮在液面上，所以不可能貼在底面上，但是如果將培養(yǎng)液加滿，那么細(xì)胞能夠與培養(yǎng)瓶上面的壁接觸同樣可以貼壁。因此可以說，細(xì)胞貼壁是適應(yīng)環(huán)境的一種反應(yīng)。

　　細(xì)胞貼壁原理及相關(guān)因素

　　大多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體內(nèi)和體外均附著于一定的底物而生長(zhǎng)，在體外時(shí)這些底物可以是其他細(xì)胞、膠原、玻璃或塑料等。

　　貼壁的過程：細(xì)胞先分泌細(xì)胞外基質(zhì)，這種細(xì)胞外基質(zhì)黏附在支持物的表面（培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿的底面）。然后，細(xì)胞通過其表面表達(dá)的黏附因子與這些細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。

　　貼壁過程

　　一些特殊的促細(xì)胞附著物質(zhì)（如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅲ型膠原、血清擴(kuò)展因子等）可能參加細(xì)胞的貼附過程。這些促細(xì)胞附著因子均為蛋白質(zhì)，存在于培養(yǎng)液尤其是血清中。在培養(yǎng)過程中，這些帶陽電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細(xì)胞再與已吸附的有促貼附物質(zhì)的底物附著，以后細(xì)胞將伸展成其原來的形態(tài)。所以細(xì)胞貼壁與否和細(xì)胞本身分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力以及細(xì)胞本身表達(dá)的黏附分子的數(shù)量有關(guān)，也與培養(yǎng)皿壁的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。

　　細(xì)胞不貼壁的一些原因

　　1. 胰酶消化時(shí)間把控不當(dāng)：消化不夠細(xì)胞本身就是成團(tuán)的；若胰酶處理太久，容易造成細(xì)胞膜蛋白損傷，使細(xì)胞貼壁不緊，顯微鏡下觀察立體感不強(qiáng)，嚴(yán)重的時(shí)候甚至?xí)�造成�?xì)胞死亡。

　　2. 缺少貼壁因子：血清中含有促貼壁因子，而無血清培養(yǎng)基工藝中由于缺少這種促貼壁因子，細(xì)胞的貼壁效果會(huì)下降很多。

　　3. 支原體或細(xì)菌的污染。

　　4. 培養(yǎng)液配制、儲(chǔ)存不當(dāng)，如pH值過堿，Gln量太少等原因。

　　5. 復(fù)蘇的細(xì)胞本身狀態(tài)不好，已經(jīng)老化，失去貼附性。

　　6. 接種細(xì)胞數(shù)目太少，無法分泌足夠的細(xì)胞外基質(zhì)。

　　7. 復(fù)蘇時(shí)處理速度太慢，復(fù)蘇過程不當(dāng)。

　　如何促進(jìn)細(xì)胞貼壁

　　1. 適度消化細(xì)胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細(xì)胞處理時(shí)間可適當(dāng)放長(zhǎng)，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落，2min足矣，P19Cl6和293細(xì)胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換新鮮培養(yǎng)基打散。

　　2. 好用塑料瓶培養(yǎng)，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾膠原包被一下培養(yǎng)瓶，或者用鹽酸對(duì)培養(yǎng)瓶進(jìn)行蝕刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以幫助細(xì)胞貼附新的培養(yǎng)瓶，細(xì)胞不易貼壁，建議加多聚賴氨酸處理。

　　3. 正確配制消化液或培養(yǎng)液。

　　4. 使用合適的細(xì)胞外基質(zhì)或貼壁試劑。

　　5. 復(fù)蘇新的細(xì)胞，周用20%血清幫助細(xì)胞復(fù)原。

　　6. 傳代接種一定要鋪的均勻，避免細(xì)胞抱團(tuán)生長(zhǎng)。

　　7. 細(xì)胞傳代24小時(shí)之內(nèi)，好不要晃動(dòng)，以免影響貼壁。

　　8. 體內(nèi)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在膠原構(gòu)成的基膜上，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上有利于生長(zhǎng)。人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)，可以用γ射線照射后的3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層，另外降低pH、Ca2+含量和溫度，均有利于上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。