技術(shù)文獻(xiàn)
菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)是發(fā)酵生產(chǎn)的道工序，該工序又稱(chēng)之為種子制備。種子制備不僅要使菌體數(shù)量增加，更重要的是，經(jīng)過(guò)種子制備培養(yǎng)出具有高質(zhì)量的生產(chǎn)種子供發(fā)酵生產(chǎn)使用。因此，如何提供發(fā)酵產(chǎn)量高、生產(chǎn)性能穩(wěn)定、數(shù)量足夠而且不被其他雜菌污染的生產(chǎn)菌種，是種子制備工藝的關(guān)鍵。
種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)
工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模越大，每次發(fā)酵所需的種子就越多。要使小小的微生物在幾十小時(shí)的較短時(shí)間內(nèi)，完成如此巨大的發(fā)酵轉(zhuǎn)化任務(wù)，那就必須具備數(shù)量巨大的微生物細(xì)胞才行。菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的就是要為每次發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短和接種量的大小有關(guān)，接種量大，發(fā)酵時(shí)間則短。將較多數(shù)量的成熟菌體接入發(fā)酵罐中，就有利于縮短發(fā)酵時(shí)間，提高發(fā)酵罐的利用率，并且也有利于減少染菌的機(jī)會(huì)。因此，種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)，不但要得到純而壯的菌體，而且還要獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的菌體。對(duì)于不同產(chǎn)品的發(fā)酵過(guò)程來(lái)說(shuō)，必須根據(jù)菌種生長(zhǎng)繁殖速度快慢決定種子擴(kuò)大培養(yǎng)的數(shù)，抗生素生產(chǎn)中，放線菌的細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖較慢，常常采用三種子擴(kuò)大培養(yǎng)。一般50 t發(fā)酵罐多采用三發(fā)酵，有的甚至采用四發(fā)酵，如鏈霉素生產(chǎn)。有些酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)也采用三發(fā)酵。而谷氨酸及其他氨基酸的發(fā)酵所采用的菌種是細(xì)菌，生長(zhǎng)繁殖速度很快，一般采用二發(fā)酵。
種子制備的過(guò)程
細(xì)菌、酵母菌的種子制備就是一個(gè)細(xì)胞數(shù)量增加的過(guò)程。細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有機(jī)氮源。細(xì)菌培養(yǎng)溫度大多數(shù)為37 ℃，少數(shù)為28 ℃，細(xì)菌菌體培養(yǎng)時(shí)間一般1～2天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌則需培養(yǎng)5～10天。
霉菌、放線菌的種子制備一般包括兩個(gè)過(guò)程，即在固體培養(yǎng)基上生產(chǎn)大量孢子的孢子制備和在液體培養(yǎng)基中生產(chǎn)大量菌絲的種子制備過(guò)程。
⒈ 孢子制備
孢子制備是種子制備的開(kāi)始，是發(fā)酵生產(chǎn)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。孢子的質(zhì)量、數(shù)量對(duì)以后菌絲的生長(zhǎng)、繁殖和發(fā)酵產(chǎn)量都有明顯的影響。不同菌種的孢子制備工藝有其不同的特點(diǎn)。
�、� 放線菌孢子的制備
放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營(yíng)養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無(wú)機(jī)鹽等。碳源和氮源不要太豐富(碳源約為1％，氮源不超過(guò)0.5％)，碳源豐富容易造成生理酸性的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，不利于放線菌孢子的形成，氮源豐富則有利于菌絲繁殖而不利于孢子形成。一般情況下，干燥和限制營(yíng)養(yǎng)可直接或間接誘導(dǎo)孢子形成。放線菌斜面的培養(yǎng)溫度大多數(shù)為28 ℃，少數(shù)為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為5～14天。
采用哪一代的斜面孢子接入液體培養(yǎng)，視菌種特性而定。采用母斜面孢子接入液體培養(yǎng)基有利于防止菌種變異，采用子斜面孢子接入液體培養(yǎng)基可節(jié)約菌種用量。菌種進(jìn)入種子罐有兩種方法。一種為孢子進(jìn)罐法，即將斜面孢子制成孢子懸浮液直接接入種子罐。此方法可減少批與批之間的差異，具有操作方便、工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、便于控制孢子質(zhì)量等優(yōu)點(diǎn)，孢子進(jìn)罐法已成為發(fā)酵生產(chǎn)的一個(gè)方向。另一種方法為搖瓶菌絲進(jìn)罐法，適用于某些生長(zhǎng)發(fā)育緩慢的放線菌，此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以縮短種子在種子罐內(nèi)的培養(yǎng)時(shí)間。
⑵ 霉菌孢子的制備
霉菌的孢子培養(yǎng)，一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。這是由于這些農(nóng)產(chǎn)品中的營(yíng)養(yǎng)成分較適合霉菌的孢子繁殖，而且這類(lèi)培養(yǎng)基的表面積較大，可獲得大量的孢子。霉菌的培養(yǎng)一般為25～28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為4～14天。
�、� 種子制備
種子制備是將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的孢子或菌體轉(zhuǎn)入到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其繁殖成大量菌絲或菌體的過(guò)程。種子制備所使用的培養(yǎng)基和其他工藝條件，都要有利于孢子發(fā)芽、菌絲繁殖或菌體增殖。
�、� 搖瓶種子制備
某些孢子發(fā)芽和菌絲繁殖速度緩慢的菌種，需將孢子經(jīng)搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進(jìn)入種子罐，這就是搖瓶種子。搖瓶相當(dāng)于微縮了的種子罐，其培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件與種子罐相似。
搖瓶種子進(jìn)罐，常采用母瓶、子瓶?jī)膳囵B(yǎng)，有時(shí)母瓶種子也可以直接進(jìn)罐。種子培養(yǎng)基要求比較豐富和完全，并易被菌體分解利用，氮源豐富有利于菌絲生長(zhǎng)。原則上各種營(yíng)養(yǎng)成分不宜過(guò)濃，子瓶培養(yǎng)基濃度比母瓶略高，更接近種子罐的培養(yǎng)基配方。
⑵ 種子罐種子制備
種子罐種子制備的工藝過(guò)程，因菌種不同而異，一般可分為一種子、二種子和三種子的制備。孢子(或搖瓶菌絲)被接入到體積較小的種子罐中，經(jīng)培養(yǎng)后形成大量的菌絲，這樣的種子稱(chēng)為一種子，把一種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱(chēng)為二發(fā)酵。如果將一種子接入體積較大的種子罐內(nèi)，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)形成更多的菌絲，這樣制備的種子稱(chēng)為二種子，將二種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱(chēng)為三發(fā)酵。同樣道理，使用三種子的發(fā)酵，稱(chēng)為四發(fā)酵。
種子罐的數(shù)主要決定于菌種的性質(zhì)和菌體生長(zhǎng)速度及發(fā)酵設(shè)備的合理應(yīng)用。種子制備的目的是要形成一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體。孢子發(fā)芽和菌體開(kāi)始繁殖時(shí)，菌體量很少，在小型罐內(nèi)即可進(jìn)行。發(fā)酵的目的是獲得大量的發(fā)酵產(chǎn)物。產(chǎn)物是在菌體大量形成并達(dá)到一定生長(zhǎng)階段后形成的，需要在大型發(fā)酵罐內(nèi)才能進(jìn)行。同時(shí)若干發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，其不同生長(zhǎng)階段對(duì)營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件的要求有差異。因此，將兩個(gè)目的不同、工藝要求有差異的生物學(xué)過(guò)程放在一個(gè)大罐內(nèi)進(jìn)行，既影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，又會(huì)造成動(dòng)力和設(shè)備的浪費(fèi)。種子罐數(shù)減少，有利于生產(chǎn)過(guò)程的簡(jiǎn)化及發(fā)酵過(guò)程的控制，可以減少因種子生長(zhǎng)異常而造成發(fā)酵的波動(dòng)。
種子培養(yǎng)
種子培養(yǎng)要求一定量的種子，在適宜的培養(yǎng)基中，控制一定的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法，從而保證種子正常生長(zhǎng)。工業(yè)微生物培養(yǎng)法分為靜置培養(yǎng)和通氣培養(yǎng)兩大類(lèi)型，靜置培養(yǎng)法即將培養(yǎng)基盛于發(fā)酵容器中，在接種后，不通空氣進(jìn)行培養(yǎng)。而通氣培養(yǎng)法的生產(chǎn)菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多，它們生長(zhǎng)的環(huán)境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長(zhǎng)和發(fā)酵，又稱(chēng)為好氣性培養(yǎng)。
⒈ 表面培養(yǎng)法
表面培養(yǎng)法是一種好氧靜置培養(yǎng)法。針對(duì)容器內(nèi)培養(yǎng)基物態(tài)又分為液態(tài)表面培養(yǎng)和固體表面培養(yǎng)。相對(duì)于容器內(nèi)培養(yǎng)基體積而言，表面積越大，越易促進(jìn)氧氣由氣液界面向培養(yǎng)基內(nèi)傳遞。這種方法菌的生長(zhǎng)速度與培養(yǎng)基的深度有關(guān)，單位體積的表面積越大，生長(zhǎng)速度越快。
�、� 固體培養(yǎng)法
固體培養(yǎng)又分為淺盤(pán)固體培養(yǎng)和深層固體培養(yǎng)，統(tǒng)稱(chēng)為曲法培養(yǎng)。它起源于我國(guó)釀造生產(chǎn)特有的傳統(tǒng)制曲技術(shù)。其大特點(diǎn)是固體曲的酶活力高。
�、� 液體深層培養(yǎng)
液體深層種子罐從罐底部通氣，送入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進(jìn)氧的溶解。這種由罐底部通氣攪拌的培養(yǎng)方法，相對(duì)于由氣液界面靠自然擴(kuò)散使氧溶解的表面培養(yǎng)法來(lái)講，稱(chēng)為深層培養(yǎng)法。其特點(diǎn)是容易按照生產(chǎn)菌種對(duì)于代謝的營(yíng)養(yǎng)要求以及不同生理時(shí)期的通氣、攪拌、溫度與培養(yǎng)基中氫離子濃度等條件，選擇佳培養(yǎng)條件。
�、� 深層培養(yǎng)基本操作的三個(gè)控制點(diǎn)
�、� 滅菌
發(fā)酵工業(yè)要求純培養(yǎng)，因此在種子培養(yǎng)必須對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行加熱滅菌。所以種子罐具有蒸汽夾套，以便將培養(yǎng)基和種子罐進(jìn)行加熱滅菌，或者將培養(yǎng)基由連續(xù)加熱滅菌器滅菌，并連續(xù)地輸送于種子罐內(nèi)。
�、� 溫度控制
培養(yǎng)基滅菌后，冷卻至培養(yǎng)溫度進(jìn)行種子培養(yǎng)，由于隨著微生物的生長(zhǎng)和繁殖會(huì)產(chǎn)生熱量，攪拌也會(huì)產(chǎn)生熱量，所以要維持溫度恒定，需在夾套中或盤(pán)管中通冷卻水循環(huán)。
�、� 通氣、攪拌
空氣進(jìn)入種子罐先經(jīng)過(guò)空氣過(guò)濾器除去雜菌，制成無(wú)菌空氣，而后由罐底部進(jìn)入，再通過(guò)攪拌將空氣分散成微小氣泡。為了延長(zhǎng)氣泡滯留時(shí)間，可在罐內(nèi)裝擋板產(chǎn)生渦流。攪拌的目的除增加溶解氧以外，可使培養(yǎng)液中的微生物均勻地分散在種子罐內(nèi)，促進(jìn)熱傳遞，以及pH均充，并使加入的酸和堿均勻分散等。
⑵ 幾種深層培養(yǎng)法
�、� 控制培養(yǎng)法
根據(jù)罐內(nèi)部的變化情況，掌握短暫時(shí)間內(nèi)狀態(tài)變量的變化以及可能測(cè)定的環(huán)境因子對(duì)微生物代謝活動(dòng)的影響，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行控制培養(yǎng)，以達(dá)到產(chǎn)物的優(yōu)培養(yǎng)條件。為此，用測(cè)定狀態(tài)變量的傳感器取得數(shù)據(jù)，經(jīng)電子計(jì)算機(jī)進(jìn)行綜合分析，再將其結(jié)果作為反饋調(diào)節(jié)的信號(hào)，將環(huán)境(培養(yǎng)條件)控制于給定的基準(zhǔn)內(nèi)。這就叫做電子計(jì)算機(jī)控制培養(yǎng)。目已大量用于露天大罐啤酒發(fā)酵。
�、� 載體培養(yǎng)法
載體培養(yǎng)法脫胎于曲法培養(yǎng)，同時(shí)又吸收了液體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)新發(fā)展的一種培養(yǎng)方法。特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麩皮之類(lèi)的固體基質(zhì)作為微生物的載體，營(yíng)養(yǎng)成分可以嚴(yán)格控制。發(fā)酵結(jié)束，只要將菌體和培養(yǎng)基擠壓出來(lái)進(jìn)行抽提，載體又可以重新使用。
③ 兩步法
在酶制劑的兩步法液體深層培養(yǎng)中，每一步菌體相同而培養(yǎng)條件不同，因?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)與產(chǎn)酶的適條件有很大的差異。例如往培養(yǎng)基中添加葡萄糖能大大增加菌體或菌絲的生長(zhǎng)，然而卻嚴(yán)重阻礙許多種酶的合成。加強(qiáng)培養(yǎng)液的通氣雖然能促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，可是在多數(shù)場(chǎng)合下反而抑制酶的合成。為了取得大的高活力酶，必須制定一種調(diào)節(jié)方法，既要求細(xì)胞的單位酶活力高，又要求細(xì)胞數(shù)量多，也就是說(shuō)，給菌體在各種生理時(shí)期創(chuàng)造不同的條件。兩步法液體深層培養(yǎng)就是實(shí)現(xiàn)這種調(diào)節(jié)的具體措施。酶制劑生產(chǎn)兩步法的特點(diǎn)是將菌體生長(zhǎng)條件(生長(zhǎng)期)與產(chǎn)酶條件(生產(chǎn)期)區(qū)分開(kāi)來(lái)。菌體先在豐富的培養(yǎng)基上大量繁殖，然后收集菌體濃縮物，洗滌后再轉(zhuǎn)入添加誘導(dǎo)物的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，在此期間，菌體積累大量的酶，一般不再繁殖，營(yíng)養(yǎng)成分或誘導(dǎo)物得到充分的利用。
種子質(zhì)量的控制
種子質(zhì)量是影響發(fā)酵生產(chǎn)水平的重要因素。種子質(zhì)量的優(yōu)劣，主要取決于菌種本身的遺傳特性和培養(yǎng)條件兩個(gè)方面。這就是說(shuō)既要有優(yōu)良的菌種，又要有良好的培養(yǎng)條件才能獲得高質(zhì)量的種子。
�、� 影響孢子質(zhì)量的因素及其控制
孢子質(zhì)量與培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、濕度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量等有關(guān)，這些因素相互聯(lián)系、相互影響，因此必須全面考慮各種因素，認(rèn)真加以控制。
�、� 培養(yǎng)基
構(gòu)成孢子培養(yǎng)基的原材料，其產(chǎn)地、品種、加工方法和用量對(duì)孢子質(zhì)量都有一定的影響。生產(chǎn)過(guò)程中孢子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，常常是原材料質(zhì)量不穩(wěn)定所造成的。原材料產(chǎn)地、品種和加工方法的不同，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中的微量元素和其他營(yíng)養(yǎng)成分含量的變化。例如，由于生產(chǎn)蛋白胨所用的原材料及生產(chǎn)工藝的不同，蛋白胨的微量元素含量、磷含量、氨基酸組分均有所不同，而這些營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)于菌體生長(zhǎng)和孢子形成有重要作用。瓊脂的牌號(hào)不同，對(duì)孢子質(zhì)量也有影響，這是由于不同牌號(hào)的瓊脂含有不同的無(wú)機(jī)離子造成的。
此外，水質(zhì)的影響也不能忽視。地區(qū)的不同、季節(jié)的變化和水源的污染，均可成為水質(zhì)波動(dòng)的原因。為了避免水質(zhì)波動(dòng)對(duì)孢子質(zhì)量的影響，可在蒸餾水或無(wú)鹽水中加入適量的無(wú)機(jī)鹽，供配制培養(yǎng)基使用。例如在配制生產(chǎn)四環(huán)素的斜面培養(yǎng)基時(shí)，有時(shí)在無(wú)鹽水內(nèi)加入0.03％(NH4)2HPO4，0.028％KH2PO4及0.01％MgSO4，確保孢子質(zhì)量，提高四環(huán)素發(fā)酵產(chǎn)量。
為了保證孢子培養(yǎng)基的質(zhì)量，斜面培養(yǎng)基所用的主要原材料，糖、氮、磷含量需經(jīng)過(guò)化學(xué)分析及搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)合格后才能使用。制備培養(yǎng)基時(shí)要嚴(yán)格控制滅菌后的培養(yǎng)基質(zhì)量。斜面培養(yǎng)基使用，需在適當(dāng)溫度下放置一定的時(shí)間，使斜面無(wú)冷凝水呈現(xiàn)，水分適中有利于孢子生長(zhǎng)。
配制孢子培養(yǎng)基還應(yīng)該考慮不同代謝類(lèi)型的菌落對(duì)多種氨基酸的選擇。菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類(lèi)型的菌落，各種氨基酸對(duì)菌落的表現(xiàn)不同。氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類(lèi)型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。斜面培養(yǎng)基上用較單一的氮源，可抑制某些不正常型菌落的出現(xiàn)；而對(duì)分離篩選的平板培養(yǎng)基則需加入較復(fù)雜的氮源，使其多種菌落類(lèi)型充分表現(xiàn)，以利篩選。因此在制備固體培養(yǎng)基時(shí)有兩條經(jīng)驗(yàn)：① 供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基或作為制備砂土孢子或傳代所用的培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，以便保持正常菌落類(lèi)型的優(yōu)勢(shì)；② 作為選種或分離用的平板培養(yǎng)基，則需采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源，目的是便于選擇特殊代謝的菌落。
�、� 培養(yǎng)溫度和濕度
微生物在一個(gè)較寬的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)。但是，要獲得高質(zhì)量的孢子，其適溫度區(qū)間很狹窄。一般來(lái)說(shuō)，提高培養(yǎng)溫度，可使菌體代謝活動(dòng)加快，縮短培養(yǎng)時(shí)間，但是，菌體的糖代謝和氮代謝的各種酶類(lèi)，對(duì)溫度的敏感性是不同的。因此，培養(yǎng)溫度不同，菌的生理狀態(tài)也不同，如果不是用適溫度培養(yǎng)的孢子，其生產(chǎn)能力就會(huì)下降。不同的菌株要求的適溫度不同，需經(jīng)實(shí)踐考察確定。例如，龜裂鏈霉菌斜面適溫度為36.5～37 ℃，如果高于37 ℃，則孢子成熟早，易老化，接入發(fā)酵罐后，就會(huì)出現(xiàn)菌絲對(duì)糖、氮利用緩慢，氨基氮回升提，發(fā)酵產(chǎn)量降低等現(xiàn)象。培養(yǎng)溫度控制低一些，則有利于孢子的形成。龜裂鏈霉菌斜面先放在36.5 ℃培養(yǎng)3天，再放在28.5 ℃培養(yǎng)1天，所得的孢子數(shù)量比在36.5 ℃培養(yǎng)4天所得的孢子數(shù)量增加3～7倍。
斜面孢子培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)室的相對(duì)濕度對(duì)孢子形成的速度、數(shù)量和質(zhì)量有很大影響。空氣中相對(duì)濕度高時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)的水分蒸發(fā)少；相對(duì)濕度低時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)的水分蒸發(fā)多。例如，在我國(guó)北方干燥地區(qū)，冬季由于氣候干燥，空氣相對(duì)濕度偏低，斜面培養(yǎng)基內(nèi)的水分蒸發(fā)的快，致使斜面下部含有一定水分，而上部易干癟，這時(shí)孢子長(zhǎng)得快，且從斜面下部向上長(zhǎng)。夏季時(shí)空氣相對(duì)濕度高，斜面內(nèi)水分蒸發(fā)得慢，這時(shí)斜面孢子從上部往下長(zhǎng)，下部常因積存冷凝水，致使孢子生長(zhǎng)得慢或孢子不能生長(zhǎng)。試驗(yàn)表明，在一定條件下培養(yǎng)斜面孢子時(shí)，在北方相對(duì)濕度控制在40％～45％，而在南方相對(duì)濕度控制在35％～42％，所得孢子質(zhì)量較好。一般來(lái)說(shuō)，真菌對(duì)濕度要求偏高，而放線菌對(duì)濕度要求偏低。
在培養(yǎng)箱培養(yǎng)時(shí)，如果相對(duì)濕度偏低，可放入盛水的平皿，提高培養(yǎng)箱內(nèi)的相對(duì)濕度，為了保證新鮮空氣的交換，培養(yǎng)箱每天宜開(kāi)啟幾次，以利于孢子生長(zhǎng)。現(xiàn)代化的培養(yǎng)箱是恒溫、恒濕，并可換氣，不用人工控制。
適培養(yǎng)溫度和濕度是相對(duì)的，例如相對(duì)濕度、培養(yǎng)基組分不同，對(duì)微生物的適溫度會(huì)有影響。培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組分不同也會(huì)影響到微生物培養(yǎng)的適相對(duì)濕度。
⒊ 培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間
絲狀菌在斜面培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程可分為五個(gè)階段：① 孢子發(fā)芽和基內(nèi)菌絲生長(zhǎng)階段；② 氣生菌絲生長(zhǎng)階段；③ 孢子形成階段；④ 孢子成熟階段；⑤ 斜面衰老菌絲自溶階段。
�、� 孢子的培養(yǎng)時(shí)間
基內(nèi)菌絲和氣生菌絲內(nèi)部的核物質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)處于流動(dòng)狀態(tài)，如果把菌絲斷開(kāi)，各菌絲片斷之間的內(nèi)容是不同的，有的片斷中含有核粒，有的片斷中沒(méi)有核粒，而核粒的多少亦不均勻，該階段的菌絲不適宜于菌種保存和傳代。而孢子本身是一個(gè)獨(dú)立的遺傳體，其遺傳物質(zhì)比較完整，因此孢子用于傳代和保存均能保持原始菌種的基本特征。但是孢子本身亦有年輕與衰老的區(qū)別。一般來(lái)說(shuō)衰老的孢子不如年輕孢子，因?yàn)樗ダ系逆咦右言谥鸩竭M(jìn)入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。孢子的培養(yǎng)工藝一般選擇在孢子成熟階段時(shí)終止培養(yǎng)，此時(shí)顯微鏡下可見(jiàn)到成串孢子或游離的分散孢子，如果繼續(xù)培養(yǎng)，則進(jìn)入斜面衰老菌絲自溶階段，表現(xiàn)為斜面外觀變色、發(fā)暗或黃、菌層下陷、有時(shí)出現(xiàn)白色斑點(diǎn)或發(fā)黑。白斑表示孢子發(fā)芽長(zhǎng)出第二代菌絲，黑色顯示菌絲自溶。孢子的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)孢子質(zhì)量有重要影響，過(guò)于年輕的孢子經(jīng)不起冷藏，如土霉素菌種斜面培養(yǎng)4.5天，孢子尚未完全成熟，冷藏7～8天菌絲即開(kāi)始自溶。而培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)半天(即培養(yǎng)5天)，孢子完全成熟，可冷藏20天也不自溶。過(guò)于衰老的孢子會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降，孢子的培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。
�、� 孢子的冷藏時(shí)間
斜面孢子的冷藏時(shí)間，對(duì)孢子質(zhì)量也有影響，其影響隨菌種不同而異，總的原則是冷藏時(shí)間宜短不宜長(zhǎng)。曾有報(bào)道，在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6 ℃冷藏2個(gè)月后的發(fā)酵單位比冷藏1個(gè)月的低18％，冷藏3個(gè)月后則降低35％。
⒋ 接種量
制備孢子時(shí)的接種量要適中，接種量過(guò)大或過(guò)小均對(duì)孢子質(zhì)量產(chǎn)生影響。因?yàn)榻臃N量的大小影響到在一定量培養(yǎng)基中孢子的個(gè)體數(shù)量的多少，進(jìn)而影響到菌體的生理狀態(tài)。凡接種后菌落均勻分布整個(gè)斜面，隱約可分菌落者為正常接種。接種量過(guò)小則斜面上長(zhǎng)出的菌落稀疏，接種量過(guò)大則斜面上菌落密集一片。一般傳代用的斜面孢子要求菌落分布較稀，適于挑選單個(gè)菌落進(jìn)行傳代培養(yǎng)。接種搖瓶或進(jìn)罐的斜面孢子，要求菌落密度適中或稍密，孢子數(shù)達(dá)到要求標(biāo)準(zhǔn)。一般一支高度為20 cm、直徑為3 cm的試管斜面，絲狀菌孢子數(shù)要求達(dá)到107以上。
接入種子罐的孢子接種量對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)也有影響。例如，青霉素產(chǎn)生菌的球狀菌的孢子數(shù)量對(duì)青霉素發(fā)酵產(chǎn)量影響大，若孢子數(shù)量過(guò)少，則進(jìn)罐后長(zhǎng)出的球狀體過(guò)大，影響通氣效果；若孢子數(shù)量過(guò)多，則進(jìn)罐后不能很好地維持球狀體。
除了以上幾個(gè)因素需加以控制之外，要獲得高質(zhì)量的孢子，還需要對(duì)菌種質(zhì)量加以控制。用各種方法保存的菌種每過(guò)1年都應(yīng)進(jìn)行1次自然分離，從中選出形態(tài)、生產(chǎn)性能好的單菌落接種孢子培養(yǎng)基。制備好的斜面孢子，要經(jīng)過(guò)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，合格后才能用于發(fā)酵生產(chǎn)。
�、� 影響種子質(zhì)量的因素及其控制
種子質(zhì)量主要受孢子質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡和接種量等因素的影響。搖瓶種子的質(zhì)量主要以外觀顏色、效價(jià)、菌絲濃度或黏度以及糖氮代謝、pH值變化等為指標(biāo)，符合要求方可進(jìn)罐。
種子的質(zhì)量是發(fā)酵能否正常進(jìn)行的重要因素。種子制備不僅是要提供一定數(shù)量的菌體，更為重要的是要為發(fā)酵生產(chǎn)提供適合發(fā)酵、具有一定生理狀態(tài)的菌體。種子質(zhì)量的控制，將以此為出發(fā)點(diǎn)。
�、� 培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基的原材料質(zhì)量的控制類(lèi)似于孢子培養(yǎng)基原材料質(zhì)量的控制。種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分應(yīng)適合種子培養(yǎng)的需要，一般選擇一些有利于孢子發(fā)芽和菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，在營(yíng)養(yǎng)上易于被菌體直接吸收和利用，營(yíng)養(yǎng)成分要適當(dāng)?shù)刎S富和完全，氮源和維生素含量較高，這樣可以使菌絲粗壯并具有較強(qiáng)的活力。另一方面，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分要盡可能地和發(fā)酵培養(yǎng)基接近，以適合發(fā)酵的需要，這樣的種子一旦移入發(fā)酵罐后也能比較容易適應(yīng)發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件。發(fā)酵的目的是為了獲得盡可能多的發(fā)酵產(chǎn)物，其培養(yǎng)基一般比較濃，而種子培養(yǎng)基以略稀薄為宜。種子培養(yǎng)基的pH值要比較穩(wěn)定，以適合菌的生長(zhǎng)和發(fā)育。pH值的變化會(huì)引起各種酶活力的改變，對(duì)菌絲形態(tài)和代謝途徑影響很大。例如，種子培養(yǎng)基的pH值控制對(duì)四環(huán)素發(fā)酵有顯著影響。
�、� 培養(yǎng)條件
種子培養(yǎng)應(yīng)選擇適溫度，面已有敘述。培養(yǎng)過(guò)程中通氣攪拌的控制很重要，各種子罐或者同種子罐的各個(gè)不同時(shí)期的需氧量不同，應(yīng)區(qū)別控制，一般期需氧量較少，后期需氧量較多，應(yīng)適當(dāng)增大供氧量。在青霉素生產(chǎn)的種子制備過(guò)程中，充足的通氣量可以提高種子質(zhì)量。例如，將通氣充足和通氣不足兩種情況下得到的種子都接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。但是，在土霉素發(fā)酵生產(chǎn)中，一種子罐的通氣量小一些卻對(duì)發(fā)酵有利。通氣攪拌不足可引起菌絲結(jié)團(tuán)、菌絲粘壁等異�，F(xiàn)象。生產(chǎn)過(guò)程中，有時(shí)種子培養(yǎng)會(huì)產(chǎn)生大量泡沫而影響正常的通氣攪拌，此時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制，甚至可考慮改變培養(yǎng)基配方，以減少發(fā)泡。
對(duì)青霉素生產(chǎn)的小罐種子，可采用補(bǔ)料工藝來(lái)提高種子質(zhì)量，即在種子罐培養(yǎng)一定時(shí)間后，補(bǔ)入一定量的種子培養(yǎng)基，結(jié)果種子罐放罐體積增加，種子質(zhì)量也有所提高，菌絲團(tuán)明顯減少，菌絲內(nèi)積蓄物增多，菌絲粗壯，發(fā)酵單位增高。
�、� 種齡
種子培養(yǎng)時(shí)間稱(chēng)為種齡。在種子罐內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌體量逐漸增加。但是菌體繁殖到一定程度，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝產(chǎn)物積累，菌體量不再繼續(xù)增加，而是逐漸趨于老化。由于菌體在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，不同生長(zhǎng)階段的菌體的生理活性差別很大，接種種齡的控制就顯得非常重要。在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，一般都選在生命力為旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體量尚未達(dá)到高峰時(shí)移種。此時(shí)的種子能很快適應(yīng)環(huán)境，生長(zhǎng)繁殖快，可大大縮短在發(fā)酵罐中的遲滯期（調(diào)整期），縮短在發(fā)酵罐中的非產(chǎn)物合成時(shí)間，提高發(fā)酵罐的利用率，節(jié)省動(dòng)力消耗。如果種齡控制不適當(dāng)，種齡過(guò)于年輕的種子接入發(fā)酵罐后，往往會(huì)出現(xiàn)期生長(zhǎng)緩慢、泡沫多、發(fā)酵周期延長(zhǎng)以及因菌體量過(guò)少而菌絲結(jié)團(tuán)，引起異常發(fā)酵等等；而種齡過(guò)老的種子接入發(fā)酵罐后，則會(huì)因菌體老化而導(dǎo)致生產(chǎn)能力衰退。在土霉素生產(chǎn)中，一種子的種齡相差2～3 h，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐后，菌體的代謝就會(huì)有明顯的差異。
適種齡因菌種不同而有很大的差異。細(xì)菌的種齡一般為7～24 h，霉菌種齡一般為16～50 h，放線菌種齡一般為21～64 h。同一菌種的不同罐批培養(yǎng)相同的時(shí)間，得到的種子質(zhì)量也不完全一致，因此適的種齡應(yīng)通過(guò)多次試驗(yàn)，特別要根據(jù)本批種子質(zhì)量來(lái)確定。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
請(qǐng)輸入要搜索的關(guān)鍵詞
上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司：細(xì)胞凍存液,氨芐青霉素溶液,人白介素ELISA試劑盒,大鼠ELISA試劑盒,小鼠ELISA試劑盒,顯色試劑盒,新生牛血清,標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清,牛血清白蛋白溶液,小鼠血漿,雞紅細(xì)胞,透明質(zhì)酸酶溶液,微生物培養(yǎng)基,胰蛋白酶儲(chǔ)存液,兩性霉素B溶液,LB冷凍緩沖液,ABTS試劑,磷酸酶抑制劑,EB緩沖液,熒光染色試劑盒,肥大細(xì)胞染色液,人源基因質(zhì)粒,胡蔓藤堿乙標(biāo)準(zhǔn)品,番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品，Pd-C-II標(biāo)準(zhǔn)品,知母皂苷E標(biāo)準(zhǔn)品,穿刺培養(yǎng)基,puc19質(zhì)粒,CPD抗凝劑,熒光抗體稀釋液
地址：上海市嘉定區(qū)曹安公路5588號(hào) 電話：021-58999639 傳真：021-58999639 技術(shù)支持：阿儀網(wǎng) 總訪問(wèn)量：7779732
客服一
