技術(shù)文獻(xiàn)
蛋白質(zhì)的提取工作是將經(jīng)過處理或破碎的細(xì)胞，置于一定的條件和溶液中，讓被提取物充分釋放出來的過程。影響提取的因素主要是被提取物質(zhì)在提取的溶液中溶解度的大小及由固相擴(kuò)散到液相的難易程度。某一物質(zhì)在溶劑中溶解度大小與該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及溶劑理化性質(zhì)有關(guān)，一般遵守“相似相溶”的原則。擴(kuò)散作用對蛋白質(zhì)的提取有一定的影響。減小溶劑的黏度、攪拌和延長提取時間可以提高擴(kuò)散速度，增加提取效果，提取的原則是“少量多次”，即對于等量的提取溶液，分多次提取比一次提取效果好得多。大部分蛋白質(zhì)都可以溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機(jī)溶劑中，因此，可采取不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)。
一、水溶液提取法
稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1～5倍，提取時需要均勻地攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度視其有效成分的性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活，因此基于這一點考慮，提取蛋白質(zhì)時一般采用低溫（5℃以下）操作。
為了避免蛋白質(zhì)提取過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸、碘/乙酸等）。
下面著重討論提取液的 pH 和鹽濃度的選擇。
1. pH 蛋白質(zhì)是具有等電點的兩性電解質(zhì)，提取液的 pH 應(yīng)選擇在偏離等電點兩側(cè)的 pH 范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時，應(yīng)防止過酸或者過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆化。一般來說，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液提取。
2. 鹽濃度 稀鹽溶液可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點，因此在提取液中加入少量 NaCl等中性鹽，一般以0.15mol/L濃度為宜。緩沖液常采用0.02～0.05mol/L磷酸鹽或碳酸鹽的等滲鹽溶液。
二、有機(jī)溶劑提取法
一些和脂類結(jié)合比較牢固或者分子中非性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮或丁醇等有機(jī)溶劑，它們具有一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性，是理想的提取脂蛋白的提取液，但必須要在低溫下操作。
丁醇提取法對提取一些與脂類結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)特別優(yōu)越，一方面是因為丁醇親脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)；另一方面，丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會引起蛋白質(zhì)的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動植物及微生物材料。
三、蛋白質(zhì)提取舉例——胰糜蛋白酶的制備
【實驗?zāi)康摹?br />掌握從組織中制備胰糜蛋白酶的原理和方法。
【實驗原理】
胰糜蛋白酶是胰腺產(chǎn)生的一種消化酶。初以酶原的形式被合成與分泌，之后在胰蛋白酶的作用下被水解而激活。胰糜蛋白酶是一種催化肽鍵的肽鏈內(nèi)切酶，主要切斷色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸的羧基側(cè)肽鍵。
酶絕大多數(shù)都是蛋白質(zhì)，因此一般提純蛋白質(zhì)的方法也適用于酶的提純，所不同的是在提純酶的過程中要不斷地進(jìn)行酶活力的檢測，本實驗主要涉及提取過程。
【實驗藥品與器材】
（一）材料和試劑
1. 主要材料：新鮮豬胰臟1個。
2. 主要試劑
2.5mol/L H2SO4溶液，固體(NH4)2SO4，氯化鈣/粉，10％三氯/乙酸溶液，1%酪蛋白溶液，）0.1mol/L pH7.4 磷酸鹽緩沖液，1％BaCl2溶液，5mol/L NaOH溶液。
（二）主要器材
組織搗碎機(jī)、手術(shù)器械、紗布、漏斗、透析袋、離心機(jī)、燒杯、pH計、離心管。
【實驗方法與步驟】
1. 提取 取新鮮豬胰臟，放在盛有冰冷2.5mol/L H2SO4溶液的容器中，保存在冰箱中待用。去除胰臟表面的脂肪和結(jié)締組織后，稱重。用組織搗碎機(jī)粉碎。然后混懸于兩倍體積的冰冷2.5mol/L H2SO4溶液中，置于冰箱中過夜。將上述混懸液以3000rpm離心10min，上層液經(jīng)兩層紗布過濾至燒杯中；將沉淀再混懸于等體積的冰冷 2.5mol/L H2SO4溶液中，再離心，將兩次上層液合并，即為提取液。此時可留樣測酶的活力。
2. 分離。
3. 結(jié)晶 取分離所得的胰糜蛋白酶溶于3倍體積的水中（此時可取0.5ml留樣測酶活力），加(NH4)2SO4（1.44g/10ml），用5mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6.0，在室溫放置12h即可出現(xiàn)結(jié)晶，在顯微鏡下觀察結(jié)晶形狀。
【注意事項】
1. 整個操作過程在0℃～5℃條件下進(jìn)行。
2. 實驗材料應(yīng)采用新鮮胰組織。
3. 分清實驗過程中每次離心后各保留的是上清液，還是沉淀。
4. 離子強(qiáng)度、pH、溫度、試管的潔凈度等均可影響酶的活性，如需進(jìn)一步進(jìn)行活性測定，務(wù)必保證固定的實驗條件，嚴(yán)格按照程序操作。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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