技術(shù)文獻(xiàn)
一、pH值對發(fā)酵的影響
發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值，對微生物生長具有非常明顯的影響，也是影響發(fā)酵過程中各種酶活的重要因素。pH值對微生物的生長繁殖和產(chǎn)物合成的影響有以下幾個(gè)方面：①影響酶的活性，當(dāng)pH值抑制菌體中某些酶的活性時(shí)，會阻礙菌體的新陳代謝；②影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細(xì)胞膜的通透性，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的排泄；③影響培養(yǎng)基中某些組分的解離，進(jìn)而微生物對這些成分的吸收；④pH值不同，往往引起菌體代謝過程的不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。
培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，是引起pH值變化的主要原因，發(fā)酵液pH值的變化乃是菌體代謝的綜合效果。由于pH值不當(dāng)，可能嚴(yán)重影響菌體的生長和產(chǎn)物的合成，因此對微生物發(fā)酵來說有各自的適生長pH值和適生產(chǎn)pH值。各種不同的微生物，對pH值的要求不同。多數(shù)微生物生長都有適pH值范圍及其變化的上下限：上限都在8.5左右，超過此上限，微生物將無法忍受而自溶；下限以酵母為/低(2.5)。但菌體內(nèi)的pH值一般認(rèn)為是中性附近。pH值對產(chǎn)物的合成有明顯的影響，因?yàn)榫w生長和產(chǎn)物合成都是酶反應(yīng)的結(jié)果，僅僅是酶的種類不同而已，因此代謝產(chǎn)物的合成也有自己適的pH值范圍，如合成青霉素的適pH值范圍為6.5～6.8。這兩種pH值的范圍對發(fā)酵控制來說都是很重要的參數(shù)。另外，pH值還會影響某些霉菌的形態(tài)。
一般認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)的H＋或OH－能影響酶蛋白的解離度和電荷情況，改變酶的結(jié)構(gòu)和功能，引起酶活性的改變。但培養(yǎng)基的H＋或OH－并不是直接作用在胞內(nèi)酶蛋白上，而是先作用在胞外的弱酸(或弱堿)上，使之成為易于透過細(xì)胞膜的分子狀態(tài)的弱酸(或弱堿)，它們進(jìn)入細(xì)胞后，再行解離，產(chǎn)生H＋或OH－，改變胞內(nèi)原先存在的中性狀態(tài)，進(jìn)而影響酶的結(jié)構(gòu)和活性。所以培養(yǎng)基中H＋或OH－是通過間接作用來產(chǎn)生影響的。pH值還影響菌體對基質(zhì)的利用速率和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，影響菌體的生長和產(chǎn)物的合成。Collnig等人發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃曲霉的細(xì)胞壁的厚度就隨pH值的增加而減�。浩渚z直徑在pH6.0時(shí)為2～3μm；pH7.4時(shí)為2～18μm，并呈膨脹酵母狀；pH值下降后菌絲形態(tài)又會恢復(fù)正常。pH值還影響菌體細(xì)胞膜的電荷狀況，引起膜透性發(fā)生改變，因而影響菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的形成等。
如同溫度對發(fā)酵影響一樣，pH值對產(chǎn)物穩(wěn)定性也有影響。如在β-內(nèi)酰胺抗生素沙納霉素(thienamycin)的發(fā)酵中，考察pH值對產(chǎn)物生物合成的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)pH6.7～7.5之間，抗生素的產(chǎn)量相近，高于或低于這個(gè)范圍，合成就受到抑制。在這個(gè)pH值范圍內(nèi)，沙納霉素的穩(wěn)定性未受到嚴(yán)重影響，半衰期也無大的變化；但pH>7.5時(shí)，穩(wěn)定性下降，半衰期縮短，發(fā)酵單位也下降。青霉素在堿性條件下發(fā)酵單位低，也與青霉素的穩(wěn)定性有關(guān)。
由于pH值的高低對菌體生長和產(chǎn)物的合成產(chǎn)生明顯的影響，所以在工業(yè)發(fā)酵中，維持適pH值已成為生產(chǎn)成敗的關(guān)鍵因素。
二、發(fā)酵過程pH值的變化
在發(fā)酵過程中，pH值的變化決定于所用的菌種、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件。在產(chǎn)生菌的代謝過程中，菌體本身具有一定的調(diào)整周圍環(huán)境pH值，構(gòu)建適pH值的能力。曾以產(chǎn)生利福霉素SV的地中海諾卡菌進(jìn)行發(fā)酵研究，采用pH值為6.0、6.8、7.5三個(gè)出發(fā)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH值在6.8、7.5時(shí)，終發(fā)酵pH值都達(dá)到7.5左右，菌絲生長和發(fā)酵單位都達(dá)到正常水平；但pH值為6.0時(shí)，發(fā)酵中期pH值只達(dá)4.5，菌濃僅為20％，發(fā)酵單位為零。這說明菌體僅有一定的自調(diào)能力。
培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，也是引起pH值變化的重要原因，發(fā)酵所用的碳源種類不同，pH值變化也不一樣。如灰黃霉素發(fā)酵的pH值變化，就與所用碳源種類有密切關(guān)系，如以乳糖為碳源，乳糖被緩慢利用，丙酮酸堆積很少，pH值維持在6～7之間；如以葡萄糖為碳源，丙酮酸迅速積累，使pH值下降到3.6，發(fā)酵單位很低。
發(fā)酵液的pH值變化是菌體代謝反應(yīng)的綜合結(jié)果。從代謝曲線的pH值變化就可以推測發(fā)酵罐中的各種生化反應(yīng)的進(jìn)展和pH值變化異常的可能原因。在發(fā)酵過程中，要選擇好發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其配比，并控制好發(fā)酵工藝條件，才能保證pH值不會產(chǎn)生明顯的波動(dòng)，維持在佳的范圍內(nèi)，得到良好的結(jié)果。實(shí)踐證明，維持穩(wěn)定的pH值，對產(chǎn)物的形成有利。
三、發(fā)酵pH值的確定和控制
�、卑l(fā)酵pH值的確定
微生物發(fā)酵的適pH值范圍一般是在5～8之間，如谷氨酸發(fā)酵的適pH值為7.5～8.0。但發(fā)酵的pH值又隨菌種和產(chǎn)品不同而不同。由于發(fā)酵是多酶復(fù)合反應(yīng)系統(tǒng)，各酶的適pH值也不相同，因此，同一菌種，生長適pH值可能與產(chǎn)物合成的適pH值是不一樣的。例如，黑曲霉pH2～3時(shí)合成檸檬酸，在pH值接近中性時(shí)積累草酸。谷氨酸生產(chǎn)菌在中性和微堿性條件下積累谷氨酸，在酸性條件下形成谷氨酰胺。谷氨酸發(fā)酵在不同階段對pH值的要求不同，發(fā)酵期控制pH7.5左右，發(fā)酵中期pH7.2左右，發(fā)酵后期pH7.0，在將近放罐時(shí)，為了后工序提取谷氨酸，pH6.5～6.8為好。如初代謝產(chǎn)物丙酮丁醇的梭狀芽孢桿菌發(fā)酵，pH值在中性時(shí)，菌種生長良好，但產(chǎn)物產(chǎn)量很低，實(shí)際發(fā)酵適pH值為5～6。次代謝產(chǎn)物抗生素的發(fā)酵更是如此，鏈霉素產(chǎn)生菌生長的適pH值為6.2～7.0，而合成鏈霉素的適pH值為6.8～7.3。因此，應(yīng)該按發(fā)酵過程的不同階段分別控制不同的pH值范圍，使產(chǎn)物的產(chǎn)量達(dá)到大。
適pH值是根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來確定的。將發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)節(jié)成不同的出發(fā)pH值進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵過程中，定時(shí)測定和調(diào)節(jié)pH值以維持出發(fā)pH值，或者利用緩沖液配制培養(yǎng)基來維持之。定時(shí)觀察菌體的生長情況，以菌體生長達(dá)到高值的pH值為菌體生長的適pH值。以同樣的方法，可測得產(chǎn)物合成的適pH值。但同一產(chǎn)物的適pH值，還與所用的菌種、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件有關(guān)。如合成青霉素的適pH值，先后報(bào)告有7.2～7.5、7.0左右和6.5～6.6等不同數(shù)值，產(chǎn)生這樣的差異，可能是所用的菌株、培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝不同引起的。在確定發(fā)酵適pH值時(shí)，要不定期考慮培養(yǎng)溫度的影響，若溫度提高或降低，適pH值也可能發(fā)生變動(dòng)。
�、瞤H值的控制
在各種類型的發(fā)酵過程中，實(shí)驗(yàn)所得的適pH值、菌體的比生長速率(μ)和產(chǎn)物比生成速率(Qp)等3個(gè)參數(shù)的相互關(guān)系有四種情況(見圖7-3)：①種情況是μ和Qp的適pH值都在一個(gè)相似的較寬的適宜范圍內(nèi)(a)，這種發(fā)酵過程易于控制；②第二種情況是Qp(或μ)的適pH值范圍很窄，而μ(或Qp)的范圍較寬(b)；③第三種情況是μ和Qp對pH值都很敏感，它們的適pH值又是相同的(c)，第二、第三種情況的發(fā)酵pH值應(yīng)嚴(yán)格控制；④第四種情況更復(fù)雜，μ和Qp有各自的適pH值(d)，應(yīng)分別嚴(yán)格控制各自的適pH值，才能優(yōu)化發(fā)酵過程。
在了解發(fā)酵過程中適pH值的要求之后，就要采用各種方法來控制。先需要考慮和試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方，使它們有個(gè)適當(dāng)?shù)呐浔龋拱l(fā)酵過程中的pH值變化在合適的范圍內(nèi)。因?yàn)榕囵B(yǎng)基中含有代謝產(chǎn)酸[如葡萄糖產(chǎn)生酮酸、(NH4)2SO4]和產(chǎn)堿(如NaNO3、尿素)的物質(zhì)以及緩沖劑(如CaCO3)等成分，它們在發(fā)酵過程中要影響pH值的變化，特別是CaCO3能與酮酸等反應(yīng)，而起到緩沖作用，所以它的用量比較重要。在分批發(fā)酵中，常采用這種方法來控制pH值的變化。
利用上述方法調(diào)節(jié)pH值的能力是有限的，如果達(dá)不到要求，可以用在發(fā)酵過程中直接補(bǔ)加酸或堿和補(bǔ)料的方式來控制，特別是補(bǔ)料的方法，效果比較明顯。過去是直接加入酸(如H2SO4)或堿(NaOH)來控制，但現(xiàn)在常用的是以生理酸性物質(zhì)[(NH4)2SO4]和堿性物質(zhì)(如氨水、尿素)來控制。它們不僅可以調(diào)節(jié)pH值，還可以補(bǔ)充氮源。當(dāng)發(fā)酵的pH值和氨氮含量都低時(shí)，補(bǔ)加氨水，就可達(dá)到調(diào)節(jié)pH值和補(bǔ)充氨氮的目的；反之，pH值較高，氨氮含量又低時(shí)，就補(bǔ)加(NH4)2SO4。在加多了消泡劑(如豆油)的個(gè)別情況下，還可采用提高空氣流量來加速脂肪酸的代謝，以調(diào)節(jié)pH值。通氨一般是使壓縮氨氣或工業(yè)用氨水(濃度20％左右)，采用少量間歇添加或連續(xù)自動(dòng)流加，可避免一次加入過多造成局部偏堿。氨易和銅反應(yīng)產(chǎn)生毒性物質(zhì)，對發(fā)酵產(chǎn)生影響，故需避免使用銅制的通氨設(shè)備。
目，已比較成功地采用補(bǔ)料的方法來調(diào)節(jié)pH值，如氨基酸發(fā)酵采用流加尿素[(NH2)2CO]的方法，特別是次代謝產(chǎn)物抗生素發(fā)酵，更常用此法。這種方法，既可以達(dá)到穩(wěn)定pH值的目的，又可以不斷補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)，特別是能產(chǎn)生阻遏作用的物質(zhì)。少量多次補(bǔ)加還可解除對產(chǎn)物合成的阻遏作用，提高產(chǎn)物產(chǎn)量。也就是說，采用補(bǔ)料的方法，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)補(bǔ)充營養(yǎng)、延長發(fā)酵周期、調(diào)節(jié)pH值和培養(yǎng)液的特性(如菌濃等)等幾個(gè)目的。成功的例子就是青霉素的補(bǔ)料工藝，利用控制葡萄糖的補(bǔ)加速率來控制pH值的變化范圍(現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化)，其青霉素產(chǎn)量比用恒定的加糖速率和加酸或堿來控制pH值的產(chǎn)量高25％。
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