選一與欲測組分相近但能完-全分離的組分做內標物（當然是樣品中沒有的組分），然后配制欲測組分和內標物的混合標準溶液，進樣得相對校正因子。再將內標物加入欲測組分的樣品中，進樣后測得欲測組分和內標物的定量參數。用內標法公式計算即可。
內標法是將一定量的純物質作內標物，加入到準確稱量的試樣中，根據被測試樣和內標物的質量比及其相應的色譜峰面積之比，來計算被測組分的含量。 選擇內標物有4個要求：
1.內標物應是該試樣中不存在的純物質；
2.它必須完-全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完-全分離；
3.加入內標物的量應接近于被測組分；
4.色譜峰的位置應與被測組分的色譜峰的位置相近，或在幾個被測組分色譜峰中間。
內標法的優(yōu)點是測定的結果較為準確，由于通過測量內標物及被測組分的峰面積的相對值來進行計算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內標法的缺點是操作程序較為麻煩，每次分析時內標物和試樣都要準確稱量，有時尋找合適的內標物也有困難。
外標法簡便，但進樣量要求十分準確，要嚴格控制在與標準物相同的操作條件下進行，否則造成分析誤差，得不到準確的測量結果。
內標與外標都是定量的一種方法而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不同的分析，面對著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問題，我想簡單而有效進行定量分析來滿足要求才是重要的。
1、以做過很多醫(yī)藥、農藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動進樣器，用外標法定量，確實重現性與穩(wěn)定性非常差，結果經常受到搞合成同事的質疑。
其實，仔細分析原因不一定就是外標法不適合這種定量分析，先我們的實驗室儀器和手段是否調整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒有其它色譜峰的干擾、選用什么進樣方式（如快速進樣還是熱針進樣）等等因素的影響都需要考慮。
如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗證對于精密度的要求，同一樣品進6針以上的RSD和配制6個樣品的定量結果RSD都能滿足小于1.5%的要求，那么這個方法用外標法就是完-全適用的，但是面的影響因素是一定要都考慮到的，否則談論這個方法是否適用就有失偏頗了。
在做過的許多出口產品的定量分析方法當中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗證過的方法，內標與外標都有（他們用的都是自動進樣）精密度都能滿足RSD小于1.5%的要求，當一個方法能夠滿足測試要求的時候，無論內標外標，都是可行的。
當然有一個分析成本和分析時間的問題，內標的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當然要比外標要高和麻煩一些了。而有些時候，可能受你實驗室現有儀器和附屬設備的影響，達不到一定的要求，而還必須進行定量分析，有時外標的結果可能就要差一些。
這時，你可能就要考慮用內標法了，可以排除手動進樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時內標可能就顯示出它的優(yōu)勢來了。
2、上面已經提到當做方法驗證的時候，當同一樣品配制6個樣品溶液用所選用的外標法進行定量的時候，RSD都滿足1.5%的要求時，也分為兩種情況，小于1%和大于1%小于1.5%。
如果RSD的結果小于1%，那這個方法就沒有什么可以懷疑的了；如果RSD的結果大于1%而在1.5%略低一些的范圍活動時，這個方法的可行性就將受到質疑，畢竟這是方法驗證，你就要考慮上面1所提到的影響因素的影響了，如果排除掉以上的影響因素。
RSD還是在1.5%附近，就要嘗試內標了，如果內標結果的RSD很好，就證明你的這個方法受實驗條件的影響很大，只能用內標了，或者干脆將原方法做大的變動，再嘗試用外標法測試。
3、而對于微量分析，比如農藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等，根據不同的限量標準要求對于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多，RSD有時可以允許達到10%甚至更高，這時可能外標法有更大的應用空間。
4、單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，個人認為還是內標優(yōu)于外標。
曾經做過一個中間體二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺為內標，RTX-5 amine（堿改性） 15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析，將配制好的控制溶液（含有內標物）自動進樣器進6針，目的物（二氨基丙醇）與內標物（二乙醇胺）峰面積比率的RSD為0.18%。
而只對這六針樣品的目的物峰（二氨基丙醇）面積求RSD，結果為0.71%，通過這一實例的結果大家就會發(fā)現到底哪個方法精密度更好了，當然是內標更好了。
當然這個化合物的檢測方法-后根據上面的驗證數據用內標和外標定量都是可以的，實驗室可以自由選擇。但內標與外標精密度結果的差異是顯然存在的事實。
結論：應用外標法能夠滿足要求，shou選還是外標法了，畢竟簡單而省事。對于精密度要求比較高、結果準確度會產生重大影響、實驗室條件不是很理想的等等條件下，用內標法還是必要的。無論應用那種方法，方法的驗證和確認都是很重要的，只要是按照程序經過驗證和確認的方法，都有其應用的空間的。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
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