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樣品處理

相對于傳統(tǒng)人工操作模式及重復(fù)使用的均質(zhì)乳缽器和攪拌刀頭，目市場上出現(xiàn)品類豐富的次性均質(zhì)袋、與樣品隔離的拍打式均質(zhì)系統(tǒng)及自動化重量梯度稀釋儀，不僅實(shí)現(xiàn)了樣品處理的自動化、標(biāo)準(zhǔn)化及批量化，而且免除了樣品間的交叉污染。

增菌培養(yǎng)及分離

不論傳統(tǒng)方法或現(xiàn)代檢測技術(shù)，受檢測靈敏度的限制，食品樣本經(jīng)處理后多需經(jīng)過增菌培養(yǎng)、選擇性分離后方可用于后續(xù)檢測分析。傳統(tǒng)微生物檢測中上述兩個(gè)步驟耗時(shí)長達(dá)24－96ｈ，為整個(gè)檢測流程中的關(guān)鍵限速步驟。因此，建立高效增菌策略以及靶標(biāo)高度特異性微生物濃縮、分離系統(tǒng)已成為實(shí)現(xiàn)微生物快速檢測的核心。

2.1 增菌條件優(yōu)化

為了縮短增菌時(shí)間、提高檢測效率，國內(nèi)外許多研究者致力于致病菌選擇性增菌條件改良。如通過單因素篩選、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的增菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，使其在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的菌液濃度達(dá)到國標(biāo)增菌方法的1.8倍；相對于通用的耗時(shí)48ｈ李氏增菌肉湯LB１和LB２兩步增菌法，美國學(xué)者研發(fā)了步法ｏPＳＵ增菌肉湯，適用于巴氏殺菌奶和熱狗等即食類食品中單增李斯特菌的快速檢測。此外，為了滿足當(dāng)食品致病菌多重化檢測的需求，在同體系內(nèi)實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)菌共增菌的富集培養(yǎng)基優(yōu)化也日益受到關(guān)注。

如針對沙門氏菌、大腸桿菌O157：Ｈ7及單增李斯特菌的復(fù)合培養(yǎng)基SEL，經(jīng)多重PCR及免疫法驗(yàn)證了其良好的復(fù)合增菌效果。國內(nèi)研究者通過優(yōu)化也分別獲得了可同時(shí)富集沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌或單增李斯特菌的共增菌培養(yǎng)基，３種致病菌在優(yōu)化條件下能以相對致的速度增殖，增菌液可滿足下游多重ＰＣＲ檢測要求，有效提高了檢測效率。

2.2  細(xì)菌分離與濃縮

近年來，國內(nèi)外學(xué)者開發(fā)了多種食源性致病菌的高效分離、濃縮法，基于其原理，主要可分為包括離心、過濾等在內(nèi)的物理法和賴于免疫反應(yīng)的吸附法。

2.2.1 密度梯度離心法

離心可將大體積樣本中的細(xì)菌經(jīng)沉淀而濃縮，而后加入梯度密度的緩沖液，經(jīng)多次的離心、洗滌終實(shí)現(xiàn)細(xì)菌與食品基質(zhì)的分離。

盡管離心法在細(xì)菌富集中具有定的優(yōu)勢，但其需經(jīng)多次離心－洗滌反復(fù)循環(huán)而實(shí)現(xiàn)，耗時(shí)且影響濃縮效率；另外，其濃縮對象為所有細(xì)菌，缺乏靶標(biāo)特異性。相對于此，基于抗原－抗體免疫反應(yīng)的吸附分離法則更顯優(yōu)勢。

2.2.2 免疫磁分離技術(shù)

免疫磁分離技術(shù)是種高效、特異性微生物富集技術(shù)。其原理在于利用磁性微球表面偶聯(lián)的抗體特異性地吸附樣品稀釋液中的靶標(biāo)菌，而后載有致病微生物的磁性顆粒在外加磁場的作用下，向磁方向聚集，棄去檢樣混合液，使致病菌得到分離和富集，從而大大縮短了常規(guī)檢測所需的冗長的增菌時(shí)間，提高檢測效率。以其高度的靶標(biāo)特異性及與下游檢測技術(shù)的良好兼容性在食品微生物快速檢測中得到廣泛應(yīng)用。

快速檢測技術(shù)

傳統(tǒng)微生物檢測方法包括形態(tài)觀察、生化鑒定及血清學(xué)分型等冗繁的操作，已不能滿足現(xiàn)代食品微生物檢測對靈敏度、特異性和時(shí)效性的要求。

3.1 分子生物學(xué)方法

此類方法在基因水平上對靶標(biāo)微生物進(jìn)行檢測，尤其適用于難培養(yǎng)或抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜微生物的鑒定及分型，主要包括ＰＣＲ、核酸分子雜交及基因芯片等技術(shù)。

3.1.1 ＰＣＲ及其衍生技術(shù)

ＰＣＲ是種體外酶促合成特定ＤＮＡ片段的技術(shù)，它通過以變性、退火和延伸３個(gè)步驟為個(gè)周期的循環(huán)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的指數(shù)增長。相對于擴(kuò)增單靶基因的常規(guī)ＰＣＲ，多重ＰＣＲ通過在同反應(yīng)體系中加入多對特異性引物來實(shí)現(xiàn)在同反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)基因，可用于同時(shí)檢測多種微生物或通過多基因交叉確認(rèn)來進(jìn)行特定微生物鑒定或種下分型。

實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ技術(shù)是種通過監(jiān)測ＰＣＲ產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)累積來定性或定量分析起始模板的方法。該法全程封閉式反應(yīng)且無需ＰＣＲ后處理，避免了交叉污染及溴化乙錠等有毒物質(zhì)的使用，具有特異性強(qiáng)、高度自動化等優(yōu)點(diǎn)。通過選取特異性基因設(shè)計(jì)引物及探針，ｑＲＴ－ＰＣＲ法近年來已在多種致病細(xì)菌、霉菌、酵母以及乳酸菌等重要食品微生物指標(biāo)的定性和定量檢測中被廣泛應(yīng)用。

盡管上述ＰＣＲ及其衍生技術(shù)具有高靈敏度、快速等優(yōu)點(diǎn)，但方法實(shí)施所需的昂貴儀器設(shè)備嚴(yán)重限制了其在我國食品檢測機(jī)構(gòu)的推廣應(yīng)用。

3.1.2 核酸分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交是利用帶有標(biāo)記的特定ＤＮＡ或ＲＮＡ探針與已變性的待檢核酸樣品進(jìn)行雜交，若樣品中存在與探針互補(bǔ)的靶標(biāo)序列則二者退火形成帶標(biāo)記的雙鏈，通過對標(biāo)記物信號有無及強(qiáng)度的檢測即可實(shí)現(xiàn)微生物定性或定量分析。 分子雜交技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵在于靶標(biāo)特異性核酸片段選取及相應(yīng)探針設(shè)計(jì)及標(biāo)記。如以葡糖苷酸酶基因設(shè)計(jì)核酸探針可用于檢測食品中的總大腸桿菌，而其不同致病型的區(qū)分則需針對特異毒力基因合成適宜的探針。由于放射性標(biāo)記存在標(biāo)記元素的半衰期短、對人體及環(huán)境不友好以及需要特殊操作設(shè)備等缺陷，近年來已逐漸被非放射性ＤＮＡ探針檢測系統(tǒng)所取代，其主要通過酶促反應(yīng)將特定的底物轉(zhuǎn)變?yōu)樯�色物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)而達(dá)到信號放大的目的。

3.1.3 基因芯片

基因芯片又稱ＤＮＡ微陣列，是種高通量的核酸分子雜交技術(shù)。它通過原位合成或顯微打印將系列探針以預(yù)設(shè)的次序固定于固相支持介質(zhì)表面，形成高密度的寡核苷酸陣列，樣品經(jīng)核酸提取、ＰＣＲ擴(kuò)增及標(biāo)記后與芯片上的探針陣列雜交，后通過熒光掃描或酶學(xué)方法檢測雜交信號的強(qiáng)度和分布以確定受檢樣品中特定微生物的存在及豐度。

食品中的微生物種群具有種類廣、豐度低、隨機(jī)性強(qiáng)等特點(diǎn)，傳統(tǒng)的培養(yǎng)、鑒定方法往往會掩蓋些低豐度或不易培養(yǎng)的微生物，而ＰＣＲ、免疫雜交等現(xiàn)代技術(shù)則多限于檢測種或少數(shù)幾種靶標(biāo)微生物或基因，難以全面分析食品受污染狀況。而基因芯片具有高通量、并行化及高度自動化等優(yōu)點(diǎn)，為食品微生物群落結(jié)構(gòu)研究、食源性致病菌多個(gè)毒力、藥敏基因的同步化、快速檢測等提供了個(gè)有力的平臺。

3.2 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法是基于抗原－抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)發(fā)展而成的蛋白質(zhì)水平上的系列檢測方法，相對于分子生物學(xué)手段其更直接地靶向微生物特異性基因的表達(dá)產(chǎn)物，在定意義上更具說服力。

3.2.1 酶聯(lián)免疫吸附測定

 酶聯(lián)免疫吸附法是將抗原－抗體免疫反應(yīng)的特異性與酶的高效催化作用有機(jī)地結(jié)合起來的種固相酶免疫分析方法。相對于傳統(tǒng)ＥＬＩＳＡ的檢測限，通過單克隆抗體雙夾心法將海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測靈敏度提高了１０００～１００００倍；而以新型碳納米管作為固相吸附材料在沙門氏菌的ＥＬＩＳＡ檢測中亦取得了類似的效果。此外，許多學(xué)者還結(jié)合ＰＣＲ技術(shù)的倍增放大效果開發(fā)ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ檢測技術(shù)，進(jìn)步提高檢測靈敏度。

酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)則是近年來在ＥＬＩＳＡ基礎(chǔ)上發(fā)展而來的新型免疫熒光檢測技術(shù)。該技術(shù)用熒光底物代替生色底物， 提高了分析靈敏度，增寬測量范圍，減少試劑的用量。Ｍｉｎｉ－ＶＩＤＡＳ即是法國梅里埃公司根據(jù)上述原理開發(fā)的款全自動酶聯(lián)免疫熒光儀，實(shí)現(xiàn)了雙抗夾心的ＥＬＩＳＡ技術(shù)的自動化。

3.2.2 免疫層析技術(shù)

免疫層析將免疫反應(yīng)和層析原理相結(jié)合， 借助毛細(xì)管作用使樣品在條狀纖維制成的膜上泳動， 其中的待測物與膜上定區(qū)域的配體發(fā)生高特異性、高親和性的免疫結(jié)合， 通過酶促顯色反應(yīng)或直接使用著色標(biāo)記物， 在短時(shí)間（２０ｍｉｎ內(nèi)）便可得到直觀的結(jié)果。

隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫層析試紙也不斷應(yīng)用于致病菌定量化檢測。此外，在同免疫層析試紙條上進(jìn)行多種食品致病菌同步檢測的方法也正逐步被開發(fā)。通過不同光信號標(biāo)記

3.2.3 乳膠凝集反應(yīng)

乳膠凝集反應(yīng)采用人工大分子乳膠顆粒標(biāo)記抗體， 使之與待測抗原發(fā)生肉眼可見的凝集反應(yīng)，以達(dá)到檢測目標(biāo)病原微生物或毒素的目的�；�于乳膠凝集檢測法的高靈敏度和特異性以及結(jié)果直觀性、操作簡易度等優(yōu)勢，近年來其在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用越發(fā)廣泛。

3.3 代謝學(xué)方法

代謝學(xué)方法是指基于微生物在生理代謝過程中發(fā)生的特異性物理、化學(xué)變化而設(shè)計(jì)的系列檢測手段，主要包括電阻抗法、ＡＴＰ發(fā)光法和微量生化法等。

3.3.1 阻抗法

阻抗法是種通過檢測細(xì)菌在生長繁殖時(shí)將電惰性生物大分子代謝為帶電荷的活性小分子所引起的培養(yǎng)液電阻和電導(dǎo)的變化來定量表征微生物的新型檢測方法。該法因具有高敏感性、特異性、反應(yīng)快速性以及可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)而在食品微生物快速檢測中被廣泛應(yīng)用。

3.3.2  ＡＴＰ生物發(fā)光法

ＡＴＰ作為機(jī)體的“能量貨幣”普遍存在于所有活體生物中且含量相對恒定，其隨機(jī)體死亡亦會被快速分解，因此測定樣品中的ＡＴＰ 濃度即可推算出其攜帶的活菌數(shù)�；�于此，ＡＴＰ發(fā)光法通過發(fā)光光度計(jì)檢測熒光素酶在ＡＴＰ的作用下氧化熒光素所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，并利用其在定范圍內(nèi)與ＡＴＰ濃度的線性關(guān)系來定量樣品中的ＡＴＰ含量，繼而推算系統(tǒng)中代謝活細(xì)胞水平。

該方法無需對樣本中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，可在數(shù)分鐘內(nèi)完成檢測，且熒光光度計(jì)小巧便攜，尤其適用于大批量食品樣本細(xì)菌污染狀況以及食品加工設(shè)備清潔度的現(xiàn)場快速檢定。如自動ＡＴＰ生物熒光技術(shù)已在歐洲和北美的乳品工業(yè)中廣泛應(yīng)用于生乳活菌數(shù)檢測、ＵＨＴ乳活菌數(shù)檢測、設(shè)備清潔度的評估及成品架售期的推算等。

3.3.3  微量生化法

為了滿足食品微生物快速化、標(biāo)準(zhǔn)化、批量化檢測的需求，目市場上出現(xiàn)了許多高精密度、高重現(xiàn)性的商品化微量生化鑒定試劑盒，大大提高了檢測速率以及結(jié)果的重現(xiàn)性。

盡管上述試劑盒已大大簡化了傳統(tǒng)微生物生化鑒定程序，但其不同反應(yīng)仍需分別加樣且結(jié)果依賴人工判讀。近年來隨著檢測科學(xué)的不斷發(fā)展，全自動微生物生化鑒定分析系統(tǒng)也應(yīng)運(yùn)而生，通過結(jié)合現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)，該系統(tǒng)可在次加樣后自動完成系列生化檢測并通過概率大近似值模型法分析后直接報(bào)告鑒定結(jié)果。上述自動生化鑒定系統(tǒng)可在４－６ｈ內(nèi)同時(shí)完成數(shù)十個(gè)樣品的分析，可滿足批量化鑒定的需求，且與其他檢測方法的結(jié)果高度吻合。

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司