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遠(yuǎn)慕實(shí)驗(yàn)：電泳中常犯的六大錯(cuò)誤
閱讀次數(shù)：2131 發(fā)布時(shí)間：2020/8/19 11:09:00

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盡管有了教科書、儀器說明書、產(chǎn)品操作指南和網(wǎng)絡(luò)教程，但周圍仍存在著多種錯(cuò)誤的操作步驟，使電泳運(yùn)行反復(fù)出現(xiàn)問題，并導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。迷你系統(tǒng)的相對低分辨率以及短運(yùn)行時(shí)間常常掩蓋了這些問題。然而，在大型凝膠的高分辨率雙向電泳中，這也是蛋白質(zhì)組學(xué)中*重要的分離方法，這些錯(cuò)誤的后果會(huì)變得更為明顯。來自GE Healthcare Life Sciences的Reiner Westermeier博士指出了電泳中常犯的幾點(diǎn)錯(cuò)誤。

1. 聚丙烯酰胺凝膠的交聯(lián)系數(shù)的錯(cuò)誤計(jì)算
聚丙烯酰胺凝膠的孔大小是由兩種因素控制的：丙烯酰胺的總濃度T和交聯(lián)度C：

其中a是丙烯酰胺的質(zhì)量，以g為單位，b是亞甲基雙丙烯酰胺的質(zhì)量，以g為單位，V是體積，以mL為單位。

錯(cuò)誤
有時(shí)候假設(shè)給定的丙烯酰胺總濃度T就是單位體積中丙烯酰胺的百分比，而交聯(lián)系數(shù)C就是單位體積中亞甲基雙丙烯酰胺的百分比。這導(dǎo)致凝膠中交聯(lián)劑的含量過高，產(chǎn)生了不透明的凝膠，不但易碎，而且高度疏水。

正確的操作
根據(jù)上面的等式配置溶液，或者使用即用型的丙烯酰胺/亞甲基雙丙烯酰胺儲備液，它可從不同的來源購買到。

2. 聚丙烯酰胺凝膠的聚合溫度和時(shí)間
丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺的聚合通常在30分鐘至一小時(shí)內(nèi)發(fā)生。然而，在這段時(shí)間內(nèi)，基質(zhì)的形成并沒有結(jié)束。所謂的沉默聚合仍在繼續(xù)，直至完整的基質(zhì)形成。這一部分的聚合過程需要數(shù)小時(shí)，并且只在室溫（20-25°C）下才能高效開展。

錯(cuò)誤
在有些實(shí)驗(yàn)室，聚丙烯酰胺凝膠在冰箱或冷庫中聚合，或者在聚合開始后一個(gè)或幾個(gè)小時(shí)就已經(jīng)使用。這可能會(huì)造成分離的干擾，尤其是當(dāng)?shù)鞍妆仨氃谔烊粭l件下分離時(shí)。并且，若下游必須開展質(zhì)譜分析，那么未完全聚合的丙烯酰胺單體或寡聚物會(huì)在質(zhì)譜圖中產(chǎn)生高的背景噪音。

正確的操作
讓凝膠聚合在室溫下過夜進(jìn)行。如果需要，凝膠可隨后儲存在冰箱或冷庫中。

3. SDS樣品中產(chǎn)生聚集物
單向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的樣品通常須在1-2 % SDS和1 %（w/v）DTT（≈65 mM）或2 %（v/v）β-巰基乙醇（≈350 mM）存在時(shí)煮沸幾分鐘，以實(shí)現(xiàn)多肽鏈的徹底變性和解折疊。

錯(cuò)誤
樣品常常在冷卻后直接上樣到SDS凝膠中。通常還原劑被部分氧化，其中一部分半胱氨酸不受保護(hù)，導(dǎo)致重折疊和多肽間聚集物的形成。重折疊形成模糊的區(qū)帶，有時(shí)是兩條帶。一些聚集物在高分子量區(qū)域形成了人為的區(qū)帶；其他聚集物則過大，無法進(jìn)入凝膠，在點(diǎn)樣孔形成了沉淀聚集。還原劑的過量可能在整個(gè)凝膠上40-60 kDa的分子量范圍內(nèi)形成兩條或三條水平線。

正確的操作
煮沸后讓樣品冷卻至60°C左右，然后加入碘乙酰胺。通常我們在100 μl樣品中加入10 μl 20%（w/v）的碘乙酰胺水溶液，并在室溫下孵育30分鐘。

通過這一步，我們可以獲得更為銳利的條帶，并排除了一些假象，如兩條帶、其他的高分子量條帶、點(diǎn)樣孔中的沉淀，以及凝膠上的線。

4. SDS電泳中運(yùn)行緩沖液的滴定
到目前為止，大部分單向和雙向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用是在基于Lämmli的不連續(xù)緩沖液系統(tǒng)中開展的[1]。其他基于磷酸鹽、咪唑或其他緩沖液的均一系統(tǒng)表現(xiàn)出的分辨率和重復(fù)性不高。在不連續(xù)的“Lämmli”系統(tǒng)中，積層膠和分離膠緩沖液是由指定pH值的Tris和氯離子緩沖液組成的 – 其中含有或不含SDS，運(yùn)行緩沖液中則包含SDS、Tris和甘氨酸。氯離子作為前導(dǎo)離子和甘氨酸作為尾隨離子之間的不連續(xù)性控制蛋白緩慢進(jìn)入聚丙烯酰胺凝膠，并實(shí)現(xiàn)積層效應(yīng)，產(chǎn)生非常銳利和清晰可辨的區(qū)帶。

錯(cuò)誤
不幸的是，有一些操作步驟建議將Tris-甘氨酸緩沖液的pH調(diào)整至pH 8.3-8.4。這導(dǎo)致上層緩沖液槽中的氯離子載量過高，產(chǎn)生下列影響：分離將比預(yù)期時(shí)間要長得多，且一些區(qū)帶不好分辨。因氯離子相對其他所有離子有著非常高的電泳遷移率，所以只有氯離子向陽極方向遷移，直到上層緩沖液槽中沒有任何的氯離子剩余。到那時(shí)蛋白離子才會(huì)開始遷移。在大型的電泳槽中，這需要幾個(gè)小時(shí)至過夜。此外，積層效果也不如理想的不連續(xù)緩沖液那樣好。

正確的操作
只使用Tris堿、甘氨酸和SDS作為運(yùn)行緩沖液。請勿滴定緩沖液，即使它的pH高于9。使用高質(zhì)量的試劑。

參考文獻(xiàn)
[1] Lämmli , U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227, 680–685.

5. 細(xì)胞中PBS的不徹底去除
在裂解細(xì)胞，分離出蛋白進(jìn)行高分辨率的雙向電泳之前，必須用等滲溶液對細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞進(jìn)行高效洗滌。通常使用PBS（磷酸鹽緩沖液）。

錯(cuò)誤
PBS溶液有時(shí)未能從細(xì)胞中徹底去除。這導(dǎo)致樣品中的鹽污染，致使雙向電泳圖中出現(xiàn)許多長的水平條紋。

正確的操作
*后一次洗滌后，必須用移液器徹底吸光細(xì)胞中的PBS溶液，一滴也不剩。如果這不太容易做到，我們建議增加一步至三步洗滌，使用250 mM蔗糖和10 mM Tris（pH 7.0）的溶液。

6. 雙向電泳中IPG膠條的過度聚焦
到目前為止，高分辨率的雙向電泳為復(fù)雜蛋白混合物的分離帶來了*-高的分辨率。因此，它是蛋白質(zhì)組分析中十分常用的方法。理想情況下，生成的雙向圖顯示了所有蛋白的清晰可辨圓點(diǎn)。不幸的是，實(shí)際情況卻常常不是這樣：有時(shí)圓點(diǎn)的某些區(qū)域模糊，有時(shí)形成了水平或垂直條紋，取代了圓點(diǎn)。這些干擾可能有很多原因，過度聚焦就是其中。

如今在第1向分離即等電聚焦中大多采用了聚丙烯酰胺膠條，它們包含了固定化的pH梯度。由于pH梯度是固定在聚丙烯酰胺基質(zhì)中的，所以當(dāng)長期暴露在電場中時(shí)它不能散開。然而，過度聚焦會(huì)導(dǎo)致雙向圖像的一些其他干擾，具體會(huì)在下文中描述。

堿性pH梯度下的蛋白降解
當(dāng)一些蛋白必須在它們的等電點(diǎn)停留一會(huì)時(shí)，它們不太穩(wěn)定。實(shí)踐表明，一些堿性蛋白在它們等電點(diǎn)的pH下對水解特別敏感。這可能導(dǎo)致某些蛋白點(diǎn)延伸出水平條紋。因此堿性IPG膠條的聚焦時(shí)間應(yīng)當(dāng)限制在*少。

“硫脲效應(yīng)”
根據(jù)Rabiloud[2]，在提取蛋白和水化IPG膠條時(shí)，向尿素中添加硫脲可提高疏水蛋白的溶解度。與只用尿素相比，生成的雙向圖顯示出明顯更多的點(diǎn)。然而，在某些情況下，在pH 5.5區(qū)域會(huì)形成一條很強(qiáng)的垂直條紋，而此條紋酸性一側(cè)的點(diǎn)會(huì)比凝膠其他部分的點(diǎn)更加模糊。這種現(xiàn)象可能會(huì)觀察到，但也并非存在于所有批次的硫脲中。但是它也與應(yīng)用在IPG膠條上的伏小時(shí)相關(guān)。如果觀察到這種現(xiàn)象，建議降低應(yīng)用在IPG膠條上的伏小時(shí)量。

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司