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技術(shù)文獻(xiàn)

ELISA實(shí)驗(yàn)顯性淡、靈敏度低怎么回事?
閱讀次數(shù)：1906 發(fā)布時(shí)間：2020/6/2 14:47:50

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問(wèn)題	序號(hào)	可能原因	解決方法
顯色淡，靈敏度偏低	1	試劑盒未充分平衡	試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開(kāi)盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）
	2	樣品不適合做ELISA檢測(cè)	樣品一般選擇培養(yǎng)上清、血清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測(cè)或者需要優(yōu)化檢測(cè)的條件（例如稀釋液的成分）
	3	酶標(biāo)板在貯存或洗后拍干時(shí)過(guò)分干燥	防止板過(guò)于干燥
	4	包被抗體遭到破壞	操作溫和，移液槍不能碰到孔底
	5	樣本和抗體孵育條件不合適	按照說(shuō)明書(shū)條件，建議孵育過(guò)程中全程振蕩孵育。
	6	洗滌浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)	按照說(shuō)明書(shū)操作。勿人為增加浸泡時(shí)間；
	7	偶聯(lián)HRP試劑污染	棄去試劑，重新配置
	8	錯(cuò)誤的稀釋偶聯(lián)HRP試劑	棄去試劑，重新配置
	9	TMB底物孵育時(shí)間過(guò)短，因非人為因素影響，需要優(yōu)化孵育時(shí)間	確定合適的孵育時(shí)間：人為判定-濃度的標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)深藍(lán)色；S4-5有淡藍(lán)色；機(jī)器判定620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值達(dá)到0.6-0.65
	10	樣本濃度過(guò)高或存在基質(zhì)效應(yīng)	建議做不同稀釋倍數(shù)，確認(rèn)樣本*佳稀釋倍數(shù)。
	11	酶標(biāo)儀濾光片設(shè)置有問(wèn)題或者波長(zhǎng)選擇不對(duì)	確認(rèn)儀器設(shè)置及選擇正確的波長(zhǎng)檢測(cè)。
	12	酶標(biāo)板不適合做ELISA	不能使用細(xì)胞培養(yǎng)板，建議使用ELISA專用高吸附力板子。
背景深，全部呈有色（通常的Elisa背景值OD<0.2）	1	洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標(biāo)記物殘留	洗液準(zhǔn)確配制；充分洗滌，靜置15秒，徹底拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染。
	2	底物污染，未避光保存，出現(xiàn)顏色	棄去底物，重新配置
	3	樣品稀釋液污染	棄去稀釋液，重新配置
	4	吸頭重復(fù)使用，未洗凈或消毒不徹底	吸頭盡可能一次性使用
	5	不正確的孵育時(shí)間，溫度（尤其是底物孵育的時(shí)間）	*為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。完全按照說(shuō)明書(shū)要求。
	6	偶聯(lián)抗體（streptavidin-HRP）濃度過(guò)高	按照說(shuō)明書(shū)調(diào)整到*佳的濃度
	7	ELISA板子不正確的貯存	酶標(biāo)板貯存于2-8 ℃；使用結(jié)合力低點(diǎn)的Elisa板
	8	沒(méi)有正確封閉	在標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中加入動(dòng)物蛋白或延長(zhǎng)封閉時(shí)間
	9	樣本溶血嚴(yán)重	建議使用非溶血或輕微溶血樣本，嚴(yán)重溶血樣本會(huì)導(dǎo)致背景偏高。
重復(fù)性不佳，高CV值	1	樣品不均一	加樣前充分混勻樣品，取樣確保移液位置一致；
	2	包被板表面遭到破壞	洗板加樣時(shí)盡量小心，避免破壞板的包被表面
	3	孔與孔之間的交叉污染	孵育后取下蓋子小心操作，避免孔與孔的污染；封板膜不能重復(fù)使用
	4	加樣量不一致	樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴
	5	邊緣效應(yīng)（外周孔顯色較中心孔深）	孵育時(shí)盡量100 rpm旋轉(zhuǎn)混勻
	6	微量加樣不準(zhǔn)確	保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性
	7	不正確的洗滌	洗液準(zhǔn)確配制；充分洗滌，靜置15秒，確定每一步的洗滌
出現(xiàn)白板，陽(yáng)性對(duì)照不顯色	1	顯色液變質(zhì)	更換新的顯色液
	2	洗滌液配制有誤	請(qǐng)按說(shuō)明書(shū)所示稀釋倍數(shù)配制
	3	未加酶結(jié)合物而認(rèn)為已加入	注意不要漏加
	4	終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜镆菏褂?/span>	每次加液前均應(yīng)看清標(biāo)簽
	5	標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法錯(cuò)誤/或標(biāo)準(zhǔn)品有問(wèn)題	請(qǐng)按照說(shuō)明書(shū)所示配置說(shuō)明書(shū)，注意單位和稀釋倍數(shù)
	6	不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑混用	建議使用同批次試劑盒。不能混用不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑。
不正常的標(biāo)準(zhǔn)曲線	1	錯(cuò)誤的方法重懸標(biāo)準(zhǔn)品	加入正確量的溶液重懸標(biāo)準(zhǔn)品，重懸充分
	2	標(biāo)準(zhǔn)品稀釋錯(cuò)誤	按照說(shuō)明書(shū)要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品
	3	標(biāo)準(zhǔn)品污染	使用一次性的滅菌吸頭，標(biāo)準(zhǔn)品貯存于2-8 ℃
	4	錯(cuò)誤的倍比稀釋步驟	按照說(shuō)明書(shū)倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品
	5	波長(zhǎng)選擇錯(cuò)誤	TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm。雙波長(zhǎng)比色分析優(yōu)于單波長(zhǎng)。
	6	標(biāo)準(zhǔn)品混用	不同批號(hào)試劑勿混用
	7	試劑盒在運(yùn)輸途中時(shí)間太長(zhǎng)，溫度太高，標(biāo)準(zhǔn)品失活	盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間，夏季應(yīng)放冰塊降溫
	8	ELISA未終止而直接檢測(cè)450nm和620nm	TMB顯色需終止后檢測(cè)，否則會(huì)出現(xiàn)620nm比450nm讀數(shù)高的現(xiàn)象。（數(shù)值仍有梯度規(guī)律）
樣品或標(biāo)準(zhǔn)品OD超出正常范圍	1	錯(cuò)誤的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋	完全按照說(shuō)明書(shū)稀釋
	2	偶聯(lián)抗體濃度過(guò)高	按照說(shuō)明書(shū)調(diào)整到*佳的濃度
	3	TMB底物孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)	調(diào)整到合適的孵育時(shí)間
	4	樣品或標(biāo)準(zhǔn)品污染	避免污染
	5	錯(cuò)誤的孵育時(shí)間或溫度	完全按照說(shuō)明書(shū)
	6	孵育時(shí)未加蓋導(dǎo)致溶液揮發(fā)和污染	貼封片或加蓋
標(biāo)曲很好，但是樣本無(wú)法計(jì)算到數(shù)值	1	標(biāo)曲選擇不合適	選擇*合適的標(biāo)曲擬合；
	2	樣本含量很低，低于靈敏度無(wú)法被檢測(cè)到	嘗試濃縮樣本或使用高敏elisa試劑盒檢測(cè)
	3	樣本含量很高，超過(guò)標(biāo)曲	建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索稀釋倍數(shù)，確保樣本OD值落在標(biāo)曲范圍內(nèi)
標(biāo)曲高濃度間無(wú)明顯趨勢(shì)	1	如OD絕對(duì)值靠譜，但是僅無(wú)梯度，則顯色過(guò)度	TMB顯色體系中建議根據(jù)S1，S2顏色進(jìn)行判斷，當(dāng)S1，S2深藍(lán)色，有明顯梯度，S5有淡藍(lán)色時(shí)即可終止。
標(biāo)曲高濃度間無(wú)明顯趨勢(shì)	2	僅作單波長(zhǎng)檢測(cè)。	由于參考波長(zhǎng)讀取非特異性檢測(cè)，如指紋、劃痕、水漬等，對(duì)結(jié)果也有影響。建議終結(jié)果以雙波長(zhǎng)為準(zhǔn)確。