哺乳動(dòng)物的大腦由數(shù)十億個(gè)神經(jīng)元組成，這些神經(jīng)元通過(guò)不同的回路連接在一起，而每個(gè)回路都參與了特定的生理功能。為了更好地了解這些不同的神經(jīng)元和回路如何與心理活動(dòng)和疾病相關(guān)聯(lián)，研究人員正在重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的三維圖。
然而，哺乳動(dòng)物大腦的3D成像是一項(xiàng)很有挑戰(zhàn)性的工作。光在穿過(guò)各層組織時(shí)會(huì)被水、脂質(zhì)和
蛋白質(zhì)等各種分子散射，這會(huì)大大降低圖像分辨率。于是，研究人員從組織中去除水和脂質(zhì)來(lái)減少散射，同時(shí)引入化學(xué)物質(zhì)讓生物組織變得透明。
2013年，哈佛大學(xué)的Karl Deisseroth及其團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出的CLARITY水凝膠技術(shù)轟動(dòng)了全世界。這項(xiàng)技術(shù)使研究人員能夠用熒光標(biāo)記物標(biāo)記小鼠神經(jīng)組織中的神經(jīng)元，然后在不切片的情況下對(duì)整個(gè)小鼠大腦進(jìn)行成像，同時(shí)保留熒光信號(hào)。
自那時(shí)起，研究人員不斷開(kāi)發(fā)出能夠更好地保留組織結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物，讓組織透明化技術(shù)不斷得到改善。*近，《The Scientist》雜志介紹了組織透明化方面的一些新技術(shù)，有助于實(shí)現(xiàn)高分辨率的大腦成像。
與脂質(zhì)兼容的透明化方法
研究者：華中科技大學(xué)，朱丹
許多組織透明化方法都會(huì)利用有機(jī)溶劑或去垢劑來(lái)降解
細(xì)胞膜的脂質(zhì)，同時(shí)采用脂質(zhì)染料來(lái)染色神經(jīng)元和細(xì)胞器。朱丹及其團(tuán)隊(duì)于是開(kāi)發(fā)出一種稱(chēng)為RTF的方法，與脂質(zhì)染料兼容（Sci Rep, 8:1964, 2018）。
RTF是一種包含水、甲酰胺和三乙醇胺的
溶液。早前，另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室無(wú)意中發(fā)現(xiàn)甲酰胺能夠讓組織變得透明。一些研究表明，甲酰胺很有可能讓蛋白質(zhì)部分變性，降低其折射率并使其更接近水和脂質(zhì)，從而創(chuàng)建了折射率更均勻的環(huán)境。
朱丹領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，利用RTF讓小鼠大腦變得透明之后，內(nèi)源蛋白的熒光信號(hào)沒(méi)有被淬滅，另一種廣泛用于軸突染色的脂質(zhì)染料Dil的信號(hào)也沒(méi)有被淬滅。其他技術(shù)大約需要一周的時(shí)間讓組織變得透明，而RTF只需要一天的時(shí)間。這個(gè)過(guò)程也是可逆的，將組織浸泡在鹽水中，透明的組織可以恢復(fù)到原始狀態(tài)。
不過(guò)，RTF不適用于厚度超過(guò)1毫米的成年小鼠腦組織。透明化的組織還存在2%到5%的收縮，這會(huì)降低組織結(jié)構(gòu)成像和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的準(zhǔn)確性。此外，
抗體滲透到透明化組織的速度會(huì)減慢，今后他們打算解決這個(gè)抗體減速問(wèn)題，從而進(jìn)一步減少組織處理時(shí)間。
小貼士：為了優(yōu)化組織的透明度，朱丹教授建議調(diào)整其實(shí)驗(yàn)方案中的處理時(shí)間。盡管RTF并未在市場(chǎng)上銷(xiāo)售，但這些試劑價(jià)格便宜，可以自行配制。她認(rèn)為，透明化過(guò)程比其他大多數(shù)組織處理技術(shù)更簡(jiǎn)單。
讓硬組織和軟組織都變得透明
研究者：德州農(nóng)工大學(xué)，Hu Zhao
現(xiàn)有的透明化方案并未同時(shí)針對(duì)大腦和脊髓等軟組織以及鈣化的硬組織（比如骨骼）進(jìn)行優(yōu)化。這使得人們難以觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)之間的完整連接，因?yàn)榧顾柚械闹車(chē)窠?jīng)連接到椎骨，而椎骨不透明無(wú)法成像。
Zhao及其團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出一種名為PEGASOS的方法，可讓軟組織和硬組織同時(shí)變得透明（Cell Res, 28:803–18, 2018）。它的不同之處在于使用聚乙二醇（PEG）來(lái)增強(qiáng)熒光信號(hào)，并增加了兩個(gè)步驟：硬組織的脫鈣和有色組織（如肝臟）的脫色。處理方法有兩種：將組織浸泡在溶液中；或用灌注泵將溶液泵到全身。
他們利用PEGASOS方法來(lái)追蹤大鼠脊柱兩個(gè)不同節(jié)段之間的軸突，并觀察脊髓內(nèi)的神經(jīng)元，而無(wú)需通過(guò)手術(shù)將它們與椎骨分開(kāi)。他們還發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)集中在某些骨骼區(qū)域內(nèi)。不過(guò)，PEGASOS的處理會(huì)導(dǎo)致組織收縮30%到40%，這可能會(huì)使組織結(jié)構(gòu)變形。
對(duì)于浸泡的組織，透明化過(guò)程大約需要7-12天。整個(gè)生物體的透明化顯然需要更長(zhǎng)的時(shí)間，因?yàn)橥该骰芤罕仨氀h(huán)處理10天，這樣年幼大鼠的透明化時(shí)間大約為三周，而成年大鼠的循環(huán)時(shí)間還要加倍，因?yàn)樗鼈兊慕M織更多。未來(lái)，研究人員打算解決組織收縮的問(wèn)題，并減少與之相關(guān)的自發(fā)熒光。
小貼士：組織透明化只是萬(wàn)里長(zhǎng)征的步，而隨后的成像和數(shù)據(jù)處理則更具挑戰(zhàn)性。Zhao博士建議新用戶(hù)不要一開(kāi)始就處理整個(gè)器官，而是從薄薄的組織切片開(kāi)始，以便熟悉整個(gè)流程。這項(xiàng)技術(shù)使用的試劑都是現(xiàn)成的，他估計(jì)整個(gè)小鼠大腦的透明化成本大約為30美元。
不但透明，而且放大
研究者：東京大學(xué)，Hiroki Ueda
現(xiàn)有的大多數(shù)大腦透明化技術(shù)都無(wú)法使組織變得完全透明，因此很難以單細(xì)胞分辨率構(gòu)建大腦圖像。東京大學(xué)的Ueda及其同事在篩選了將近1,700種化學(xué)物質(zhì)后，開(kāi)發(fā)出一種名為CUBIC-X的方法，不僅可讓腦組織變得透明，而且還能膨脹數(shù)倍（Nat Neurosci, 21:625–37, 2018）。
他們將組織浸沒(méi)在親水性試劑中，使大腦的體積膨脹約十倍。利用這種操作，Ueda及其同事能夠?qū)穸葹?厘米的小鼠大腦進(jìn)行成像，而不會(huì)丟失任何細(xì)胞。此外，由于膨脹的組織中大約99％是水，因此整個(gè)大腦各層的折射率幾乎保持不變。這會(huì)使組織變得透明，并使得單細(xì)胞成像的光透射率接近100％。
不過(guò)，這種讓組織膨脹的化學(xué)物質(zhì)往往會(huì)淬滅神經(jīng)元和RNA標(biāo)記的熒光信號(hào)。利用CUBIC-X讓整個(gè)小鼠大腦變得透明，大約需要16天。下一步，Ueda希望將這種技術(shù)應(yīng)用在其他器官，包括心和肺。
小貼士：研究人員創(chuàng)建了開(kāi)放獲取的小鼠大腦地圖集CUBIC-Atlas。用戶(hù)可將其數(shù)據(jù)與這個(gè)地圖集進(jìn)行比較，評(píng)估大腦透明化處理的重復(fù)性。CUBIC-X試劑現(xiàn)已上市（Tokyo Chemical Industry），25 mL的售價(jià)為50美元，足夠處理一只小鼠的大腦。
保護(hù)功能出色的SHIELD方法
研究者：麻省理工學(xué)院，Kwanghun Chung（CLARITY技術(shù)的開(kāi)發(fā)者）
在組織透明化的過(guò)程中，人們往往利用酶和化學(xué)物質(zhì)來(lái)消化組織，去除脂質(zhì)，有時(shí)還會(huì)讓樣品脫水。這個(gè)過(guò)程不可避免地會(huì)降解蛋白質(zhì)和RNA，破壞關(guān)鍵的分子信息，還會(huì)淬滅熒光信號(hào)。Chung及其同事采用一種稱(chēng)為聚環(huán)氧化物的材料來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。
研究人員篩選了六種環(huán)氧化物，并通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬來(lái)確定哪種能地保留綠色熒光蛋白（GFP）的熒光。然后，他們將選定的環(huán)氧化物注入轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中，這些小鼠的神經(jīng)元表達(dá)GFP。在那里，環(huán)氧化物與GFP發(fā)生反應(yīng)，形成柔性化學(xué)鍵。這些鍵能夠避免GFP在透明化過(guò)程中變性，并允許GFP在處理后重新回到其天然構(gòu)象。
Chung及其同事表明，這種名為SHIELD的方法可保持熒光蛋白的信號(hào)，保護(hù)內(nèi)源性蛋白質(zhì)和RNA的結(jié)構(gòu)，并降低自發(fā)熒光（Nat Biotechnol, 37:73–83, 2019）。它可以保留蛋白質(zhì)與抗體結(jié)合的能力，以及RNA轉(zhuǎn)錄本與探針結(jié)合的能力。
整個(gè)小鼠大腦的SHIELD處理大約需要四天。隨后的組織透明化還需要四到六天，故整個(gè)過(guò)程總共需要兩周。下一步，研究人員計(jì)劃將SHIELD用于更大的器官甚至腫瘤。他們還開(kāi)發(fā)出一種改進(jìn)的系統(tǒng)，可促進(jìn)抗體對(duì)組織的滲透，從而加快標(biāo)記速度。
小貼士：組織經(jīng)過(guò)SHIELD處理后會(huì)變得較硬，延緩抗體滲透的速度，因此整個(gè)小鼠大腦的抗體標(biāo)記時(shí)間須延長(zhǎng)兩天。SHIELD已上市，可聯(lián)系Life Canvas Technologies購(gòu)買(mǎi)。一個(gè)500毫升的
試劑盒售價(jià)為1,000美元，能夠處理大約16只小鼠的大腦。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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