Western Blot已經成為實驗室中檢測
蛋白質的常規(guī)手段。不過想要得到一張條帶清晰、沒有雜帶、背景干凈的圖片，還是具有一定挑戰(zhàn)性的。我們在做蛋白電泳和Western Blot時，多數(shù)都用的Bio-Rad公司的
儀器，所以Bio-Rad蛋白方面的技術專家的確可以稱之為專家，因為每天都有很多人向他們請教。他們就將*常見的問題整理成《Western Blotting Troubleshooter》。我們節(jié)選了一部分，希望能幫你節(jié)省一些查資料的時間。
Q：我的結果是膜上一片空白。為什么會這樣？
A：導致這種結果的因素很多。
膠和膜放反了 如果在轉印的過程中，膠和膜的位置顛倒了，那么蛋白就從膠上轉移到緩沖液中，而不會到達膜上。對于標準的轉印，凝膠應靠近三明治的負極，而膜對應正極。
轉膜效率低 轉膜效率受多種因素影響，包括蛋白的大小、凝膠中丙烯酰胺的百分比、電場強度、轉印時間和緩沖液的pH值。一般說來，蛋白越大，轉移得越慢。轉移大蛋白的方法是用高的電場強度。而小蛋白長時間處于高電場強度下可能會穿出轉印膜。避免這個問題的方法是用0.2 um孔徑的NC膜或PVDF膜進行轉印。如果蛋白的等電點接近緩沖液的pH值，那么這個蛋白攜帶的電荷很少，在電場中也幾乎不移動。如果你的目的蛋白是強堿性的，那么你可以用碳酸鹽（pH9.9）、CAPS（pH11）及酸性緩沖液。
在轉印之后，你可以通過染膠或第二塊膜來判斷轉印效率。為了幫助你直接監(jiān)控轉印效率，Bio-Rad也提供了多種預染Marker，它們在電泳以及轉膜之后可直接觀察到。
試劑放置太久或存放條件不正確
抗體會慢慢降解，如果反復凍融的話，它會快速降解。底物應儲存在-20°C。
抗體不純或滴度太低 一抗的濃度差異很大，應該根據(jù)經驗來決定一抗的稀釋度。過猶不及，太多的抗體也會阻礙抗原與抗體的結合。一般的原則是以1:100-1:1000來稀釋血清或組織培養(yǎng)上清，以1:1000-1:10000來稀釋腹水或超免疫動物的血清。Bio-Rad的印跡級別的二抗稀釋度是1:3000。
酶失活了 疊氮鈉是辣根過氧化物酶的抑制劑。不要在HRP顯色的western blot中使用任何含疊氮鈉的試劑。疊氮鈉可以用于堿性磷酸酶結合的抗體中，而無副作用。另外，自來水或用聚苯乙烯樹脂去離子的水也可能會使酶失活，只能使用蒸餾的去離子水。
使用Tween-20洗滌 Tween-20（吐溫-20）可能會干擾某些抗體-抗體相互作用，或洗走NC膜上的目的蛋白。盡管在洗滌時它的終濃度只有0.05%-0.1%，但仍可能會影響結合。因此除了封閉之后的次洗滌，其他洗滌過程中都不使用Tween-20，不過，這可能會使背景升高。
檢測系統(tǒng)缺乏足夠的靈敏度 確保蛋白的上樣量在檢測系統(tǒng)的靈敏度范圍內：
辣根過氧化物酶 500 pg/band
堿性磷酸酶 100 pg/band
增強的堿性磷酸酶 5 pg/band
膠體金 100 pg/band
增強的膠體金 10 pg/band
Immun-Star 化學發(fā)光 10 pg/band
Q：我的western blot總是背景過高，如何解決？
A：背景過高可能是由很多因素引起的：封閉不完全、顯色過度、洗滌不充分、轉移緩沖液或設備有污染、抗體稀釋度不對或抗體不純。
封閉不完全 一抗或二抗只要結合到膜上，就會顯色。為了避免非特異性的結合，應用封閉液孵育膜，使所有的空白位點都被封閉蛋白占有。NC膜推薦的封閉液是3%的明膠。在室溫孵育1小時。明膠不能在4℃孵育，因為它會凝結。如果想要低溫封閉的話，可以用3%的BSA。PVDF膜推薦的封閉液是5%的脫脂奶粉。脫脂奶粉不能與Bio-Rad生物素化的蛋白標準一起使用。脫脂奶粉濃度過高也可能會產生背景。
顯色過度 顯色時間的長短取決于蛋白條帶的數(shù)目以及你想要的靈敏度。如果膜在顯色液中放置太久，背景就會偏高。應當在蛋白條帶清晰可見，而背景幾乎沒有或很少時，將膜及時取出。
洗滌不充分 在封閉以及抗體孵育之后，至少要洗兩次膜，每次5分鐘。去污劑的濃度不要太高，否則會把抗原從膜上洗下來。
轉移緩沖液或設備污染 使用清潔劑將轉印槽內外徹底清洗干凈。海綿墊也一定要認真清洗。臟的海綿墊通常是污染的*主要原因。另外，每次轉膜時的緩沖液都要是新鮮配制的。
抗體稀釋度不正確 一抗的稀釋度應根據(jù)抗體來源和經驗來決定。一般來說，以1:100-1:1000來稀釋血清或組織培養(yǎng)上清，以1:1000-1:10000來稀釋腹水或超免疫動物的血清。Bio-Rad的印跡級別的二抗稀釋度是1:3000�？贵w稀釋度不夠，會產生非特異的結合，帶來高背景。
二抗不純 沒有交叉吸附過的二抗可能會與膜上的其他蛋白相互作用，產生雜帶。
Q：在轉膜的過程中，緩沖液總是很熱，我該怎么辦？
A：如果緩沖液過熱，它就會分解，產生更多的熱量。這可是一個大問題。為了避免分解，一定要確保你的冷卻設備沒問題，使用的是推薦的緩沖液，而且不在過高的功率下轉印。
足夠的冷卻條件 在大部分情況下，都應當使用循環(huán)冷卻水來進行冷卻。在冷庫中轉印，或將轉印槽放置在冰浴中都是不行的。因為大部分轉印槽都是塑料做的，不能有效地散熱。另外，由于膠附近的緩沖液通常是靜止的，在轉印過程中應攪動來維持循環(huán)。
緩沖液 轉印緩沖液的離子濃度必須是已知的，來防止過熱。如果離子濃度過高，電壓就應該降低（恒流轉印），如果是恒壓轉印的話，就會過熱。
功率條件 轉印過程中產生的熱是與功率成正比的。我們都知道，功率是電壓與電流的乘積。P="IE" 而電壓、電流和電阻又滿足這個等式：R="V/I。當緩沖液分解時，電阻下降。如果電壓是恒定的，則電流上升。因此，功率上升，產生更多的熱量。如果電流是恒定的，則電壓和功率下降，使蛋白轉移得更慢。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
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