技術(shù)文獻(xiàn)
PCR反應(yīng)的準(zhǔn)備
PCR反應(yīng)體系
| 10×擴(kuò)增緩沖液 | 10μl |
| 4種dNTP混合物（終濃度） | 各100～250μmol/L |
| 引物（終濃度） | 各5～20μmol/L |
| 模板DNA | 0.1～2μg |
| Taq DNA聚合酶 | 5～10 U |
| Mg2+（終濃度） | 1～3mmol/L |
| 補(bǔ)加雙蒸水 | 100 μl |
其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整，以上表格只提供大致參考值。
PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DNA/片段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。
引物有多種設(shè)計(jì)方法，由PCR在實(shí)驗(yàn)中的目的決定，但基本原則相同。
PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯(cuò)配。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇。
模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來源，但有兩個(gè)原則，第1純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制。
緩沖液的成分為復(fù)雜，除水外一般包括四個(gè)有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價(jià)陽離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價(jià)陽離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。
PCR引物設(shè)計(jì)：
PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。
（1）引物設(shè)計(jì)的基本原則
引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。
引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC/好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。
引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。
兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。
引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完/全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。
引物3‘端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，/佳選擇是G和C。
引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高/辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。
（2）引物設(shè)計(jì)軟件
Primer Premier5.0 （自動(dòng)搜索）
vOligo6 （引物評價(jià)）
vVector NTI Suit
vDNAsis
vOmiga
vDNAstar
vPrimer3 （在線服務(wù)）
模板的制備
PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。
模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。
標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯/仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。
反應(yīng)的控制
PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子
鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L
底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L
TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）
引物 濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L
反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)
變性溫度和時(shí)間 95℃，30s
退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃
延伸溫度和時(shí)間 72℃，1min/kb(10kb內(nèi)）
Tm值=4(G+C) +2(A+T)
循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。
循環(huán)參數(shù)
預(yù)變性
模板DNA完/全變性與PCR酶的完/全激活對PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。
變性步驟
循環(huán)中一般95℃，30足以使各種靶DNA序列完/全變性，可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間。變性時(shí)間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹/底，易造成擴(kuò)增失敗。
引物退火
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。
引物延伸
引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶適溫度）。但在擴(kuò)增長度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp。
循環(huán)數(shù)
大多數(shù)PCR含25-35循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。
/后延伸
在/后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完/全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。
PCR的步驟
標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：
DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA
退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。
延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性/佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。
每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示：現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是/佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。
PCR的檢測
PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜喗菀仔校蔀榱酥髁鳈z測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。
PCR反應(yīng)的特點(diǎn)
特異性強(qiáng)
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。
靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量的起始待測模板擴(kuò)增到微克（μg=10-6）水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位）；在細(xì)菌學(xué)中小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。
簡便、快速
PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
純度要求低
不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板�？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測。
PCR實(shí)驗(yàn)的常見問題
PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些/好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。
假陰性
不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹/底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。
陰性
需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長/期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)
降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul�；�100ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。
假陽性
出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。
引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶：
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完/全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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