結(jié)晶紫法活性測定
1、取對數(shù)生長/期的人胰腺癌SW1990細胞，用0.25%胰酶（以無鈣鎂離子PBS溶液配制，pH7.4）消化后，加入RPMI-1640培養(yǎng)基（10%新生牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，pH7.2）吹打細胞，使形成細胞懸液。進行細胞計數(shù)，使細胞數(shù)為2~2.5x105個/ml。接種于96孔細胞培養(yǎng)板，100µl/孔。接種細胞時須不斷搖動細胞懸液，以保/證各孔細胞數(shù)的均勻一致。96孔板放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22h，觀察到孔中細胞長滿70~80%。
2、在上述RPMI-1640完/全培養(yǎng)基中加入放線菌素D，使終濃度為1.5µg/ml，配成樣品稀釋液。取此稀釋液900µl至Eppendorf管中，另在9個5ml管中加入700µl稀釋液。
3、用完/全培養(yǎng)基將基因工程人腫瘤凋亡素樣品（上海恰爾生物技術(shù)有限公司研制，批號：0304，凍干粉劑，
蛋白濃度：2mg/支）復(fù)溶至1000µl（液體樣品測定蛋白濃度后，直接進行下一步操作），取出100µl至已裝有900µl稀釋液的Eppendorf管中，充分混勻，盡量不起泡沫。再從此管中吸出100µl至下一管中，如此反復(fù)n次（即測定10倍稀釋若干次，直到與估計活性相接近時）。
4、從/后稀釋的Eppendorf管中吸出700µl樣品至已裝有700µl稀釋液的5ml管中，充分混勻。再從此管中吸出700µl至下一管同樣裝有700µl稀釋液的5ml管中，如此反復(fù)9次（即測定時倍比稀釋樣品）。
5、棄去96孔板中舊的培養(yǎng)基，從第/一個5ml管中吸取已稀釋的樣品100µl至第2排細胞孔中，每個稀釋度作6復(fù)孔(n=6)；從第二個5ml管中吸取的樣品加入第3排細胞中，依此類推，直至第10排孔結(jié)束。第1排中不含細胞，加入100µl/孔含有放線菌素D的稀釋液作空白對照；第11排加100µl/孔稀釋液作細胞對照；第12排加不含放線菌素D的RPMI-1640完/全培養(yǎng)基。
6、將加好樣品的96孔板置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)22h，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，初步判斷結(jié)果。
7、棄除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，每孔加入100µl染色液（1.5mmol/L結(jié)晶紫）染色30min。洗去染色液，甩去水分并在吸水紙上拍打以使干燥。沖洗程度以在吸水紙上拍打時，沒有顏色出現(xiàn)為宜。
8、充分干燥后，每孔加入100µl33%濃度的冰醋酸，在振蕩儀上充分振蕩使結(jié)晶溶解。設(shè)定λ=595nm酶聯(lián)檢測儀測定各孔的吸光值，據(jù)此數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計算出對細胞50%殺傷時所需的基因工程人腫瘤凋亡素的濃度。
[活性計算]
活性單位定義：在上述測定條件下，以50%SW1990腫瘤細胞被殺傷時，為基因工程人腫瘤凋亡素的1個活性單位。
1、樣品的稀釋度取常用對數(shù)。
2、根據(jù)對應(yīng)的細胞毒活性（光密度值）與稀釋度的對數(shù)，進行線性回歸，得到計算公式y(tǒng)=ax+b，分析相關(guān)系數(shù)R值，符合統(tǒng)計學(xué)要求者進行下一步分析。
3、代入50%殺傷時的光密度值（即第11排細胞光密度值的一半），計算出稀釋倍數(shù)的對數(shù)，再求出稀釋倍數(shù)。
4、根據(jù)原樣品濃度及稀釋倍數(shù)計算出基因工程人腫瘤凋亡素對細胞50%殺傷時的濃度，再算出比活性。
5、其他細胞的檢測方法同上，計算時根據(jù)對SW1990標定的基因工程人腫瘤凋亡素活性單位，先求出對細胞50%殺傷時的所需活性單位，再根據(jù)基因工程人腫瘤凋亡素對SW1990細胞殺傷的比活性算出相應(yīng)的絕對量。
[計算結(jié)果]
0304批原液：比活為：1.03×107活性單位/mg
蛋白的生物活性及結(jié)構(gòu)測定方法
生物活性測定[37,38]是將人胰腺癌1990細胞以2×105個/ml種入96孔細胞培養(yǎng)板，37℃ 5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6小時，用完/全培養(yǎng)液（加有1.2µg/m的放線菌素D）做梯度稀釋的樣品加入細胞板（n=3）。置37℃ 5% CO2 培養(yǎng)箱，18h后棄上清，以結(jié)晶紫固定液（結(jié)晶紫0.5%，甲醛8%，NaCl0.1%，乙醇20%）染色15min，蒸餾水洗去結(jié)晶紫。每孔再加入200μ33%的乙酸，旋渦混勻，置酶聯(lián)儀讀出D（595）值，以未加細胞的空白孔為D本底。根據(jù)活性單位定義：使培養(yǎng)孔中的細胞50%死亡為一個單位。
MTT法——活性測定
1、 接種細胞：用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞，用含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔103-104 個細胞接種于96孔板中，每孔體積200μl。
2、 培養(yǎng)細胞：將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)3-5天。（培養(yǎng)時間取決于實驗?zāi)康暮鸵螅?br />3、 呈色：培養(yǎng)第3-5天后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μl，37℃，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液上清。每孔加入150μlDMSO（二甲基亞砜），振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。
4、 比色：選擇490nm波長，在酶標儀上測定個孔吸收值，記錄結(jié)果。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
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