核酸是分子生物學的基礎，而核酸提取是整個分子行業(yè)繞不過去的門檻，很多時候一份樣本的核酸提取的好壞直接決定了檢測結(jié)果的有效性。核酸分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根據(jù)功能的不同分為核糖體RNA(rRNA)，信使RNA（mRNA）和轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）。DNA主要集中在細胞核內(nèi)，線粒體和葉綠體中，而RNA主要分布在細胞質(zhì)當中。
核酸中因為嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，所以核酸具有紫外吸收的特性，DNA鈉鹽的紫外吸收在260nm附近，其吸光率以A260表示，在230nm處于吸收低谷，因此可以使用紫外分光光度計對核酸進行定量及定性測定。核酸為兩性電解質(zhì)，相當于多元酸，可以使用中性或偏堿性的緩沖液使核酸解離成陰離子，置于電場中向陽運動，這就是電泳的原理。
核酸的化學性質(zhì)
①酸效應：在強酸和高溫，核酸完/全水解為堿基，核糖或脫氧核糖和磷酸。在濃度略稀的的無機酸中，易水解的化學鍵被選擇性的斷裂，一般為連接嘌呤和核糖的糖苷鍵，從而產(chǎn)生脫嘌呤核酸。
②堿效應
1． DNA：當PH值超出生理范圍（pH7~8）時，對DNA結(jié)構(gòu)將產(chǎn)生更為微妙的影響。堿效應使堿基的互變異構(gòu)態(tài)發(fā)生變化。這種變化影響到特定堿基間的氫鍵作用，結(jié)果導至DNA雙鏈的解離，稱為DNA的變性
2．RNA：PH較高時，同樣的變性發(fā)生在RNA的螺旋區(qū)域中，但通常被RNA的堿性水解所掩蓋。這是因為RNA存在的2`-OH參與到對磷酸脂鍵中磷酸分子的分子內(nèi)攻擊，從而導至RNA的斷裂。
③化學變性：一些化學物質(zhì)能夠使DNA/RNA在中性PH下變性。由堆積的疏水剪輯形成的核酸二結(jié)構(gòu)在能量上的穩(wěn)定性被削弱，則核酸變性。
核酸的物理性質(zhì)
①黏性：DNA的高軸比等性質(zhì)使得其水溶液具有高黏性，很長的DNA分子又易于被機械力或超聲波損傷，同時黏度下降。
② 浮力密度：可根據(jù)DNA的密度對其進行純化和分析。在高濃度分子質(zhì)量的鹽溶液（CsCl）中，DNA具有與溶液大致相同的密度，將溶液高速離心，則CsCl趨于沉降于底部，從而建立密度梯度，而DNA終沉降于其浮力密度相應的位置，形成狹帶，這種技術(shù)成為平衡密度梯度離心或等密度梯度離心。
③穩(wěn)定性：核酸的結(jié)構(gòu)相當穩(wěn)定，其主要原因有1、堿基對間的氫鍵2、堿基的堆積作用3、環(huán)境中的陽離子。
核酸提取純化原則和要求
1、保/證核酸一結(jié)構(gòu)的完整性
2、排除其它分子的污染（如提取DNA時排除RNA的干擾）
3、核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和高濃度的金屬離子
4、盡可能降低
蛋白質(zhì)、多糖和脂類等大分子物質(zhì)
核酸提取應注意的問題
1.簡化步驟，縮短提取時間
2.減少化學因素對核酸的降解
3.減少物理因素對核酸的降解：機械剪切力和高溫
4.防止核酸的生物降解
提取類型
1、總RNA提取
總RNA中，75-85%為rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA)，其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等組成。
2、miRNA提取
MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子，如小干擾RNAs (siRNAs)，通過與他們的堿基配對調(diào)節(jié)其同源mRNA的分子表達，以預防通過各種機制的表達。他們已成為進行發(fā)育、細胞增殖、分化和細胞周期的重點監(jiān)管機構(gòu)。
3、基因組DNA提取
進行基因結(jié)構(gòu)和功能研究以及基因診斷，通常要求得到的片段長度不小于100～200kb。在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保/證DNA的完整性，為后續(xù)的實驗打下基礎。
4、質(zhì)粒抽提
質(zhì)粒抽提方法即去除RNA，將質(zhì)粒與細菌基因組 DNA分開，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對純凈的質(zhì)粒。
核酸提取的主要步驟
1、裂解細胞
去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子時，應去除RNA，反之亦然。
2、沉淀核酸
純化核酸，去除鹽類，有機劑等雜質(zhì)
核酸提取純化方法
1、酚/氯/仿抽提法
1956年發(fā)明，通過酚/氯/仿處理細胞破碎液或者組織勻漿后，在水相中主要溶解以DNA為主的核酸成分，在有機相中主要是脂類物質(zhì)，蛋白質(zhì)位于兩相之間。
DNA提取的經(jīng)典方法，即所謂的酚-氯/仿提取法。因為使用兩種不同的有機溶劑交替抽提更容易將蛋白除去，提取次序為酚、酚/氯/仿（1：1）、氯/仿，這種方法提取的DNA純度高、片段大、效果好，缺點是較為繁瑣。
說明：
回收上層水相時，一定不要接觸兩相的界面，以免將蛋白質(zhì)等物質(zhì)吸入新離心管。沉淀DNA，無水乙醇是/選的有機溶劑。另：異丙醇、醋酸鈉等。70%乙醇漂洗DNA，是為了去除殘余的鹽類，去除過量SDS和酚等雜物，因為SDS在70%的乙醇中保持溶解狀態(tài)，不與DNA共沉淀，從而通過棄上清液去除這種去污劑,避免對以后PCR反應的影響。TE緩沖液：10mmol/L Tris-Hcl 1mmol/L EDTA pH 8.5或 8
2、醇沉淀法
乙醇能夠消除核酸的水化層，使帶負電荷的磷酸基團暴露出來，NA﹢等帶正電荷離子能與磷酸基團結(jié)合，形成沉淀。
3、層析柱法
旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)是用于微量核酸分離純化的較為簡單的方法，屬于硅吸附方法的一種，市場上的離心柱雖各有特色，但在原理上通�？煞譃槿齻�部分：
（1）利用裂解液促使細胞破碎，使細胞中的核酸釋放出來。
（2）把釋放出的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，這種載體只對核酸有較強的親和力和吸附力，對其他生化成分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則基本不吸附，因而在離心時被甩出柱子。
（3）把吸附在特異載體上的核酸用洗脫液洗脫下來，分離得到純化的核酸。
4、熱裂解堿法
堿法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓撲學上的差異來分離他們，在堿性下，變性蛋白是可溶的。
5、煮沸裂解法
加熱處理DNA溶液，利用線性DNA分子的特性，通過離心將DNA/片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片形成的沉淀分離。
6、納米磁珠法
運用納米技術(shù)對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。依據(jù)與硅膠膜離心柱相同的原理，運用納米技術(shù)對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高/效結(jié)合。利用氧化硅納米微球的超順磁性，在Chaotropic鹽（鹽酸胍、異硫氰酸胍等）和外加磁場的作用下，能從血液、動物組織、食品、病原微生物等樣本中的DNA和RNA分離出來，可應用在臨床疾病診斷、輸血安全、法醫(yī)學鑒定、環(huán)境微生物檢測、食品安全檢測、分子生物學研究等多種域。
7、其他方法
除了上述常用的方法之外，還有超聲法、反復凍融法、酶解法及低滲裂解等等多種方法。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
客服一
